張夢(mèng)曉 尚 曼 張 琦 王 瑤 吳艷娜 宋君秋 劉艷霞

大鼠循環(huán)血中血小板和內(nèi)皮細(xì)胞來源微囊泡的檢測(cè)*

張夢(mèng)曉 尚 曼 張 琦 王 瑤 吳艷娜 宋君秋 劉艷霞△

目的 建立流式細(xì)胞術(shù)對(duì)大鼠循環(huán)血中細(xì)胞微囊泡（MVs）的檢測(cè)方法，并測(cè)定心肌缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）處理大鼠循環(huán)血中血小板來源的MVs（PMVs）及內(nèi)皮細(xì)胞來源的MVs（EMVs）。方法大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，室溫下經(jīng)兩步離心獲得無血小板血漿（PFP）。PFP中分別加入FITC標(biāo)記的血小板表面標(biāo)志物CD61單抗或PE標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD144單抗，采用1 μm標(biāo)準(zhǔn)微球做粒徑對(duì)照，2 μm標(biāo)準(zhǔn)微球用于計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果3.5%枸櫞酸鈉與血液按體積比1∶4混勻，離心后可得均勻、清亮的上清。PFP中1 μm以下粒子信號(hào)占全部信號(hào)的99%以上。PMVs和EMVs分別為CD61陽性和CD144陽性的粒子，直徑均小于1 μm。IPC處理大鼠循環(huán)血中PMVs、EMVs水平分別為（4 053±1 987）個(gè)/μL、（4 870±825）個(gè)/μL。結(jié)論成功建立和優(yōu)化了流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定大鼠循環(huán)血中MVs的方法，并通過對(duì)IPC處理大鼠循環(huán)血中PMVs和EMVs的測(cè)定對(duì)MVs的檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

血小板；內(nèi)皮細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；大鼠,Wistar；細(xì)胞微囊泡；缺血預(yù)適應(yīng)

細(xì)胞微囊泡（microvesicels,MVs）是細(xì)胞激活或凋亡時(shí)細(xì)胞表面釋放的囊泡狀結(jié)構(gòu)，由脂質(zhì)雙層包裹，攜帶親本細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物，內(nèi)含細(xì)胞器、核酸、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，直徑小于1 μm[1]。循環(huán)血中血小板來源的MVs(platelet-derived MVs,PMVs)是血小板活化的標(biāo)志，內(nèi)皮細(xì)胞來源的MVs(endothelial cell-derived MVs,EMVs)可反映內(nèi)皮功能。PMVs和EMVs數(shù)量和表型的改變與心絞痛、心肌梗死、糖尿病等多種疾病狀態(tài)關(guān)系密切[2-4]，并對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究以大鼠為研究對(duì)象，檢測(cè)心肌缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning,IPC）模型大鼠循環(huán)血中的PMVs和EMVs，采用熒光素標(biāo)記的特異性抗體與標(biāo)準(zhǔn)微球相結(jié)合的手段，建立大鼠循環(huán)血中MVs的流式檢測(cè)方法，為MVs相關(guān)基礎(chǔ)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康雄性Wistar大鼠，3～6個(gè)月齡，體質(zhì)量220～250 g，清潔級(jí)，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生醫(yī)學(xué)與環(huán)境研究所。（2）藥品與試劑。枸櫞酸鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），多聚甲醛（Boster immunoleader公司），1 μm和2 μm標(biāo)準(zhǔn)微球（Molecular Probe），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗大鼠CD61單抗及FITC標(biāo)記的小鼠IgG1（BD公司），PE標(biāo)記的抗大鼠CD144單抗及PE標(biāo)記的小鼠IgG1（Santa Cruz公司）。（3）實(shí)驗(yàn)儀器。BL-420E生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及HX-100E型小動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司），3-18K高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（BD公司），HQ-60-Ⅱ渦旋混合器（北方同正公司）。

1.2 無血小板血漿（platelet-free plasma,PFP）的制備 分離暴露大鼠腹主動(dòng)脈，用預(yù)先吸有0.5 mL 3.2%枸櫞酸鈉或1 mL 3.5%枸櫞酸鈉的5 mL注射器，配21G針頭，取血至5 mL，輕輕顛倒數(shù)次混勻。離心2 600×g，15 min。取上清，再次離心10 000×g，5 min，上清即PFP。在PFP中加入終濃度為1%的多聚甲醛，室溫條件下固定1 h，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣本的處理 將多聚甲醛固定的PFP自-80℃冰箱取出，置于37℃水浴中迅速融化后放于冰上。取70 μL PFP，加入10 μL小鼠血清和20 μL 10%BSA，室溫條件下封閉30 min。取4支EP管，分為FITC及PE同型對(duì)照管、PMVs及EMVs測(cè)定管。每管中各加入封閉后的PFP 10 μL。PMVs和EMVs測(cè)定管中分別加入FITC標(biāo)記的血小板表面標(biāo)志物CD61單抗和PE標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD144單抗5 μL；FITC及PE同型對(duì)照管中分別加入PE標(biāo)記的小鼠IgG1和FITC標(biāo)記的小鼠IgG15 μL，室溫條件下避光孵育30 min。每管加入300 μL PBS，渦旋混勻后，取300 μL至流式上樣管中，加入5×104個(gè)2 μm的標(biāo)準(zhǔn)微球，渦旋后上機(jī)檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MVs 采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，將前向角散射信號(hào)（forward scatter,FSC）及側(cè)向角散射信號(hào)（side scatter,SSC）均置于Log通道。取未經(jīng)標(biāo)記的PFP加入1及2 μm混合標(biāo)準(zhǔn)微球，渦旋后上樣，建立FSC-SSC對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖，調(diào)節(jié)光電倍增管（photomultiplier tube,PMT）電壓。根據(jù)FSC設(shè)門R1，MVs粒徑小于1 μm。取熒光標(biāo)記后的樣本上機(jī)分析，將R1內(nèi)收集到的粒子進(jìn)一步在FL1或FL2通道進(jìn)行FITC或PE熒光強(qiáng)度的分析。PMVs定義為粒徑小于1 μm且CD61+；EMVs定義為粒徑小于1 μm且CD144+。循環(huán)血PMVs或EMVs的濃度=（R1內(nèi)粒子數(shù)/流式圖中2 μm標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)）×上樣管內(nèi)2 μm標(biāo)準(zhǔn)微球濃度×陽性率×稀釋倍數(shù)。

1.5 IPC處理大鼠循環(huán)血中PMVs和EMVs的測(cè)定 大鼠（n=5）麻醉后開胸，冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）下穿線，穩(wěn)定15 min。結(jié)扎LAD造成供應(yīng)區(qū)域的心肌缺血，放松LAD使心肌恢復(fù)血流灌注。心臟LAD經(jīng)歷5 min缺血，繼之5 min再灌注，重復(fù)3次，建立IPC模型。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后，按前述方法進(jìn)行PMVs和EMVs測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血液進(jìn)行抗凝處理的效果 采用較低濃度枸櫞酸鈉的抗凝效果不佳。3.2%枸櫞酸鈉與血液按體積比1∶9抗凝，大鼠血液常呈現(xiàn)出部分凝血狀態(tài)，表現(xiàn)為離心后上層呈膠凍狀。改用3.5%枸櫞酸鈉與血液按體積比1∶4抗凝，離心后可得均勻、清亮的上清，抗凝效果良好。

2.2 PFP制備的效果 依次經(jīng)歷室溫條件下2 600×g離心10 min和10 000×g離心5 min得到的PFP中，1 μm以下粒子信號(hào)占全部信號(hào)的99%以上，循環(huán)血中的細(xì)胞成分已被去除，見圖1。

2.3 對(duì)MVs設(shè)門的結(jié)果 超純水代替樣品上機(jī)檢測(cè)，儀器噪聲主要集中在FSC 102以下，見圖2 A。使用PFP上樣時(shí)，可見在FSC 1 μm以下、102以上有較集中的信號(hào)群，即MVs，見圖2 B、C。

2.4 PMVs及EMVs的鑒定結(jié)果 （1）PMVs鑒定結(jié)果。FITC同型對(duì)照管PFP中加入FITC標(biāo)記的小鼠IgG1進(jìn)行孵育后，粒子呈FITC熒光陰性，見圖3A。PMVs測(cè)定管PFP中加入FITC標(biāo)記的CD61單抗進(jìn)行孵育后，可得FITC熒光陽性粒子群，見圖3 B、C。（2）EMVs鑒定結(jié)果。與PE同型對(duì)照相比，EMVs測(cè)定管PFP中加入PE標(biāo)記的CD144單抗進(jìn)行孵育后，粒子的PE熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯偏移，見圖4。

2.5 IPC處理大鼠循環(huán)血中PMVs及EMVs的檢測(cè)結(jié)果 IPC處理大鼠循環(huán)血中PMVs、EMVs水平分別為（4 053±1 987）個(gè)/μL、（4 870±825）個(gè)/μL。

3 討論

健康人體內(nèi)有少量的MVs。在多種疾病狀態(tài)下，MVs的數(shù)量和表型發(fā)生明顯改變，而這種變化對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸均產(chǎn)生影響。MVs的檢測(cè)方法主要有流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法、顯微鏡檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法及色譜法等。其中，流式細(xì)胞術(shù)由于具有分析速度快、可同時(shí)對(duì)檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行定性及定量分析等特性，已成為MVs檢測(cè)最常用的方法。

大鼠在心血管藥理學(xué)，特別是在心肌缺血/再灌注損傷(IRI)及其機(jī)制的研究中應(yīng)用十分廣泛，其心血管系統(tǒng)反應(yīng)穩(wěn)定、靈敏[5-6]。對(duì)人血液中MVs的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法報(bào)道較多[2,7-8]，由于人和大鼠血液成分存在差異，用于人血液中MVs檢測(cè)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法不適于對(duì)大鼠標(biāo)本的檢測(cè)，影響與MVs相關(guān)基礎(chǔ)研究的開展。本文選用大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立循環(huán)血中MVs的檢測(cè)方法，為后期研究MVs在大鼠IRI及IPC中的作用和機(jī)制打下基礎(chǔ)。在分析前血樣的準(zhǔn)備過程中，影響較大的因素為取血針頭的直徑、取血后的抗凝處理、離心條件的選擇以及樣本的儲(chǔ)存條件等。取血條件會(huì)影響MVs檢測(cè)，若針頭過細(xì)（22 G以上），則過高的流體剪切力會(huì)導(dǎo)致血小板激活，且易發(fā)生溶血；而針頭過粗，則不便于對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈的穿刺。因此，本研究選用21 G的針頭進(jìn)行取血。

凝血過程中血小板會(huì)被激活，導(dǎo)致PMVs形成并釋放。因此，必須對(duì)血液進(jìn)行抗凝處理。最常用的抗凝劑為枸櫞酸鈉[9]，也有研究使用EDTA或肝素[10]。Lacroix等[7]的研究顯示，與肝素和EDTA相比，枸櫞酸鈉抗凝極大地減少了MVs在體外的持續(xù)釋放，且用枸櫞酸鈉抗凝的血液在室溫條件下顯示出更好的穩(wěn)定性。檢測(cè)人血中MVs時(shí)通常采用3.2%枸櫞酸鈉，抗凝劑與血液的比例是1∶9。筆者采用此種抗凝方案時(shí)，大鼠血液常出現(xiàn)部分凝血現(xiàn)象，表現(xiàn)為離心后血漿中出現(xiàn)膠凍狀物。鼠類血液中血小板的含量是人類的4～5倍[9]，其血液的凝血活性較強(qiáng)，需要加大抗凝劑的用量。本研究顯示，采用3.5%的枸櫞酸鈉與血液按體積比1∶4混勻，離心后上清均勻、清亮，抗凝效果良好。

離心條件對(duì)血液中MVs的分析至關(guān)重要[10]。筆者先采用2 600×g，離心10 min以去除血液中絕大多數(shù)的細(xì)胞成分，再采用10 000×g，離心5 min以去除殘余血小板及1 μm以上的細(xì)胞碎片。對(duì)PFP的流式分析結(jié)果顯示，99%以上的信號(hào)集中在1 μm以下，說明經(jīng)過兩步離心后，血液中的細(xì)胞成分基本去除完全。

標(biāo)本的儲(chǔ)存條件也會(huì)對(duì)MVs的分析產(chǎn)生影響。低溫會(huì)導(dǎo)致血小板形態(tài)的改變，增加取血后MVs在體外的繼續(xù)釋放[8]。血樣經(jīng)一步離心得到的貧血小板血漿，凍融后，其PMVs含量是新鮮樣本的10倍[11]。若凍存是不可避免的，則應(yīng)該先對(duì)血樣進(jìn)行兩步離心，得到PFP，再進(jìn)行凍存。文獻(xiàn)報(bào)道，-80℃保存1年的PFP，其中MVs的數(shù)量無變化[7-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)在取血后立即離心，且前兩步離心均在室溫下進(jìn)行，以避免低溫造成的血小板激活，最后將PFP液氮速凍后-80℃保存，以最大程度地減少M(fèi)Vs數(shù)量在體外的改變。

在使用流式細(xì)胞儀對(duì)MVs進(jìn)行分析的過程中，儀器的調(diào)節(jié)、標(biāo)準(zhǔn)微球的應(yīng)用以及特異性表面標(biāo)志物的選擇等對(duì)于MVs的成功檢測(cè)非常關(guān)鍵。由于MVs的體積小，接近流式細(xì)胞儀的檢測(cè)下限，極易受雜質(zhì)和儀器噪聲的干擾。因此，本研究采用1μm的標(biāo)準(zhǔn)微球做粒徑對(duì)照，設(shè)置FSC電壓，將純水產(chǎn)生的信號(hào)扣除，以減少背景噪音的干擾。同時(shí)，利用熒光素標(biāo)記的特異性表面標(biāo)志物抗體對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)記，以將特定來源的MVs從樣本中識(shí)別出來。本研究采用單一特異性表面標(biāo)志物標(biāo)記法[12-13]，是因?yàn)椴⒎撬蠱Vs表面均帶有磷脂酰絲氨酸，即不是所有MVs都呈Annexin V陽性，尤其是EMVs[9]，采用Annexin V進(jìn)行標(biāo)記，存在假陰性。并且，由于MVs體積很小，若像細(xì)胞一樣同時(shí)標(biāo)記多種抗體，可能由于一種抗體產(chǎn)生的膜表面占位效應(yīng)影響其他抗體的檢測(cè)結(jié)果。血小板特異性表面標(biāo)志物有CD31、CD41、CD42和CD61，PMVs被定義為CD61+[12]或CD31+/CD42+。內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物有CD144、CD105和CD54，EMVs被定義為CD144+， CD31+/CD42b-或CD54+，其中，CD144的特異性最強(qiáng)，是公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物。因此，本研究選用單抗體標(biāo)記，分別采用CD61和CD144對(duì)PMVs及EMVs進(jìn)行鑒定。流式結(jié)果顯示，加入FITC標(biāo)記的CD61單抗或PE標(biāo)記的CD144單抗后，均可得到熒光陽性粒子，表明所選擇的抗體能成功的將所需的表型鑒定出來。

隨著研究的不斷深入，對(duì)MVs的關(guān)注已擴(kuò)展到疾病相關(guān)的治療與保護(hù)措施方面[12]。MVs作為細(xì)胞間傳遞的新途徑，承載著多種多樣的生物學(xué)功能，其在缺血性心臟病的相關(guān)研究中已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[13-14]。而IPC作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制，已被廣泛認(rèn)可，但其確切機(jī)制尚未完全闡明。本研究為今后從MVs角度探討IPC機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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（2013-10-25 收稿 2013-12-30修回）

（本文編輯 李國琪）

Detection of Platelets and Endothelial Cell-Derived Microvesicles in Rat Peripheral Blood

ZHANG Mengxiao,SHANG Man,ZHANG Qi,WANG Yao,WU Yanna,SONG Junqiu,LIU Yanxia
Department of Pharmacology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

ObjectiveTo establish a flow-cytometric method to detect microvesicles(MVs)in rat peripheral blood, and to detect platelets-derived MVs(PMVs)and endothelial cell-derived MVs(EMVs)in blood from ischemic preconditioning(IPC)treated rats.MethodsBlood was withdrawn from rat abdominal aorta and anticoagulated with sodium citrate. Platelets-free plasma(PFP)was isolated through two centrifugations at room temperature.PFP was incubated with FITC-conjugated mouse anti-rat CD61 or PE-conjugated mouse anti-rat CD144.Standard beads in diameter of 1 and 2 μm were used for calibration and absolute counting,respectively.Analysis was performed on flow cytometer.ResultsWhen 3.5%sodium citrate was mixed with blood at volume ratio of 1∶4,clear supernatant was collected after centrifugation.Signals of particles smaller than 1 μm accounted for more than 99%of overall signals.PMVs and EMVs were CD61 positive and CD144 positive,respectively.Their diameters were both smaller than 1 μm.The concentration of PMVs and EMVs in peripheral blood from IPC treated rats was(4 053±1 987)/μL and(4 870±825)/μL,respectively.ConclusionThe method for MVs detection by flow cytometry was successfully established and optimized,and verified through detecting PMVs and EMVs in peripheral blood from IPC treated rats.

blood platelets;endothelial cells;flow cytometry;rats,Wistar;microvesicels;ischemic preconditioning

Q24

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.011

*天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：11JCZDJC18300）；高校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20101202110005)；天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20110106）

天津醫(yī)科大學(xué)藥理教研室（郵編300070）

△通訊作者 E-mail:liu_yanxia126@126.com