趙采云 尹利榮 孫俊杰

周細胞在子宮內(nèi)膜異位癥血管生成中的作用

趙采云 尹利榮△孫俊杰

目的 探討周細胞在子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）血管生成中的作用。方法采用免疫組化方法（SP法）檢測60例EMs患者（EMs組）在位內(nèi)膜（增殖期、分泌期內(nèi)膜各20例）、異位內(nèi)膜20例及40例非子宮內(nèi)膜異位癥患者（對照組）子宮內(nèi)膜（增殖期、分泌期各20例），分別選用平滑肌肌動蛋白α（α-SMA）標記平均周細胞數(shù)（PN）和CD34標記微血管密度（MVD），并對二者比值（PN/MVD）進行比較，分析周細胞與EMs血管生成之間的關(guān)系。結(jié)果EMs組異位內(nèi)膜MVD高于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜（P＜0.05），在位內(nèi)膜增殖期、分泌期的MVD與相應(yīng)的正常內(nèi)膜比較差異均無統(tǒng)計學意義，在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組內(nèi)比較均為分泌期高于增殖期（P＜0.05）。EMs組異位內(nèi)膜PN低于正常增殖期內(nèi)膜（P＜0.05），與正常分泌期內(nèi)膜相比差異無統(tǒng)計學意義，在位內(nèi)膜增殖期、分泌期的PN與相應(yīng)的正常內(nèi)膜相比差異均無統(tǒng)計學意義，組內(nèi)比較均分泌期低于增殖期（P＜0.05）；EMs組異位內(nèi)膜的PN/MVD低于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜（P＜0.05）。在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期的PN/MVD與相應(yīng)的正常內(nèi)膜比較，均為在位內(nèi)膜低于正常內(nèi)膜（P＜0.05），組內(nèi)比較均分泌期低于增殖期（P＜0.05）。結(jié)論周細胞對EMs血管生成起著重要作用，周細胞覆蓋率是判定子宮內(nèi)膜血管成熟度和穩(wěn)定性的重要指標。

子宮內(nèi)膜異位癥；新生血管化,生理性；周細胞；免疫組織化學；微血管密度；血管生成

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是育齡期婦女的常見病、多發(fā)病，雖是良性疾病，卻具有種植、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為，有“良性癌”之稱。EMs的發(fā)生、發(fā)展及消退等過程高度依賴血管生成。大量關(guān)于血管生成的研究證實，周細胞在生理和病理性血管生成中起著重要的作用，周細胞不僅作為新生血管的重要組成部分參與血管生成，還具有調(diào)節(jié)血管成熟、穩(wěn)定的功能[1-3]。本研究采用免疫組織化學法（SP法）對異位、在位及正常子宮內(nèi)膜中微血管密度（MVD）和平均周細胞數(shù)（PN）進行檢測，并對兩者的比值（PN/MVD）進行分析，以探討周細胞在EMs血管生成中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年7月—2013年7月在我院婦科接受卵巢EMs病灶切除術(shù)或附件切除術(shù)，且術(shù)后病理檢查證實為卵巢EMs的患者60例作為研究組，年齡24～48歲，平均（34.0±7.4）歲，異位內(nèi)膜20例，在位內(nèi)膜40例（其中增殖期、分泌期內(nèi)膜各20例）。選取同期因子宮平滑肌瘤行手術(shù)治療的患者40例作為正常對照組，經(jīng)術(shù)后病理證實為正常子宮內(nèi)膜，排除子宮內(nèi)膜異位癥及子宮內(nèi)膜疾病，年齡28～50歲，平均（37.3±7.8）歲，其中正常增殖期、正常分泌期內(nèi)膜各20例。所有患者月經(jīng)周期規(guī)律，無婦科內(nèi)分泌疾病、生殖系統(tǒng)腫瘤及感染，手術(shù)前6個月未接受激素治療、無妊娠及哺乳史。標本采集均經(jīng)患者知情同意。

1.2 主要試劑及方法 鼠抗人原始造血細胞CD34單克隆抗體、即用型鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體以及即用型SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水至石蠟包埋,行4～5 μm厚切片，烤片后行HE染色，經(jīng)病理醫(yī)師確診為研究所需內(nèi)膜，后行免疫組化染色?？乖迯?fù)使用高溫修復(fù)法，具體步驟嚴格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染、封片、觀察，檢測子宮內(nèi)膜組織中CD34、平滑肌肌動蛋白α（α-SMA）的表達。已知胰腺癌組織作為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 檢測指標的定性與定量 切片分別于低倍鏡和高倍鏡下觀察，抗體抗原陽性反應(yīng)呈棕黃色，且染色明顯高于背景，CD34為內(nèi)皮細胞胞膜陽性，SMA為周細胞胞漿陽性。MVD計數(shù)：首先在×100視野下選擇計數(shù)部位，然后在×400視野下計數(shù)CD34陽性的微血管數(shù)，單個內(nèi)皮細胞作為1個計數(shù)單位，不論是否形成管腔或管腔內(nèi)有無紅細胞，殘存血管或血管腔直徑＞8個紅細胞者不計數(shù)，每例分別讀取5個不重復(fù)的視野計數(shù)，然后計算單位視野（×400）的平均值，即為MVD。PN計數(shù)：首先在×100視野下選擇計數(shù)部位，在×400視野下計數(shù)微血管SMA陽性的周細胞數(shù)，每例分別選取5個不重復(fù)的視野計數(shù)，計算單位視野的平均值，即為PN。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 18.0軟件進行處理，計量資料用±s表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tamhane’s T2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜中MVD的比較 正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜相比較，CD34陽性的內(nèi)皮細胞數(shù)呈逐漸增加趨勢，且同正常內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜內(nèi)由單個內(nèi)皮細胞組成、未形成管腔或直徑較小的微血管明顯增加，見圖1。各組內(nèi)膜MVD定量結(jié)果顯示：異位內(nèi)膜高于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜（P＜0.05）；在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期與相應(yīng)的正常內(nèi)膜相比差異均無統(tǒng)計學意義；在位內(nèi)膜分泌期高于增殖期，正常內(nèi)膜分泌期高于增殖期（P＜0.05），見表1。

Table 1 Comparison of MVD、PN and PN/MVD level in endometrium between different groups表1 各組內(nèi)膜MVD、PN及PN/MVD水平比較（n=20，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，d與（4）比較，P＜0.05

組別異位內(nèi)膜（1）在位增殖期（2）在位分泌期（3）正常增殖期（4）正常分泌期（5）F MVD（條/HP）47.25±2.69 23.00±1.72 33.50±2.91b22.05±1.28a33.35±2.70ad377.36＊＊PN（個/HP）14.50±1.47 24.95±2.28 14.55±1.32b26.75±3.26a15.45±1.10d176.61＊＊PN/MVD 0.31±0.03 1.08±0.05 0.44±0.03b1.21±0.14ab0.46±0.03acd710.29＊＊

2.2 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜PN的比較 正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜相比較，α-SMA陽性的周細胞依次遞減，在正常內(nèi)膜中α-SMA陽性細胞位于微血管的外周，符合周細胞的組織學分布，并可見α-SMA陽性細胞形成的條索狀或管腔樣微血管，而在異位內(nèi)膜中α-SMA陽性細胞表達減少，呈散在、單一細胞分布，不形成微血管樣結(jié)構(gòu)，多數(shù)微血管上無或僅有1個α-SMA細胞分布，見圖2。內(nèi)膜PN定量結(jié)果顯示：異位內(nèi)膜低于正常增殖期內(nèi)膜（P＜0.05），而與正常分泌期內(nèi)膜相比差異無統(tǒng)計學意義；在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期與相應(yīng)的正常內(nèi)膜相比差異均無統(tǒng)計學意義；在位內(nèi)膜增殖期高于分泌期，正常內(nèi)膜增殖期高于分泌期（P＜0.05），見表1。

2.3 異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜PN/MVD的比較 異位內(nèi)膜低于正常增殖期和正常分泌期內(nèi)膜；在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期均低于相應(yīng)的正常內(nèi)膜；在位內(nèi)膜增殖期高于分泌期，正常內(nèi)膜增殖期高于分泌期(均P＜0.05)，見表1。

3 討論

血管生成是指從已存在的血管生出新血管的過程，病理性血管生成主要發(fā)生于惡性腫瘤、缺血性、炎癥性疾病中[4]。周細胞是除內(nèi)皮細胞外血管的另一重要組分，周細胞在血管生成之前，其結(jié)構(gòu)和功能即發(fā)生改變，參與誘導(dǎo)血管生成；在血管生成初期起著引導(dǎo)和支持作用[5]。除此之外，周細胞與內(nèi)皮細胞之間通過多種信號途徑相互作用共同調(diào)節(jié)血管形成、穩(wěn)定、重塑等[1]。Betsholtz[2]通過針對轉(zhuǎn)基因小鼠的研究證實，應(yīng)用基因敲除的方法抑制周細胞的增殖、遷移、募集后，小鼠出現(xiàn)廣泛的內(nèi)皮細胞增殖、血管擴張、微血管瘤形成，于胚胎期死亡。還有研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤血管幼稚化、不成熟、不穩(wěn)定等特征以及腫瘤細胞的血管轉(zhuǎn)移均與周細胞數(shù)量和周細胞/內(nèi)皮細胞比值下降有關(guān)[3]。

EMs被認為是一種依賴于血管生成的疾病[6-7]，具有種植、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學行為，同時有研究指出EMs的發(fā)生及發(fā)展程度同病灶局部的炎癥性反應(yīng)密切相關(guān)[8]，然而大量關(guān)于周細胞及血管生成的研究多局限于腫瘤和炎癥性疾病，周細胞在EMs血管生成中的研究卻鮮有報道。本研究結(jié)果顯示：無論EMs組在位內(nèi)膜還是對照組正常內(nèi)膜，分泌期內(nèi)膜MVD均高于增殖期內(nèi)膜，PN和PN/MVD則增殖期內(nèi)膜高于分泌期內(nèi)膜，表達隨月經(jīng)呈周期性改變，說明子宮內(nèi)膜血管生成活躍時周細胞數(shù)量減少、周細胞覆蓋下降，驗證了周細胞對維持血管成熟、穩(wěn)定的重要作用；異位內(nèi)膜MVD明顯高于對照組正常內(nèi)膜，進一步證實了EMs是一種依賴于血管生成的疾病，豐富的血供是異位病灶的存活、生成的前提，也是EMs病灶發(fā)生出血、壞死等病變的基礎(chǔ)。異位內(nèi)膜的PN低于正常增殖期內(nèi)膜，與正常分泌期內(nèi)膜相比差異無統(tǒng)計學意義，而異位內(nèi)膜的PN/MVD比值低于正常增殖期和分泌期內(nèi)膜，說明同正常內(nèi)膜相比，特別是同血管增殖相對活躍的分泌期內(nèi)膜相比，異位內(nèi)膜中周細胞的總數(shù)無明顯差異，但是異位內(nèi)膜血管中平均每個微血管上的周細胞數(shù)減少，即周細胞覆蓋率降低，血管成熟度和穩(wěn)定性較差，更易發(fā)生異常增殖和出血，正如臨床所見EMs腹腔內(nèi)病灶往往變現(xiàn)為表面血管豐富，多呈分支、網(wǎng)狀、密集狀態(tài)，常伴有出血和壞死。

近年來有報道指出，腹腔鏡檢查顯示90%的女性經(jīng)期都會發(fā)生經(jīng)血逆流但是并非所有都發(fā)生EMs，故有學者提出了在位內(nèi)膜決定論[9]。同非EMs患者相比，EMs患者的在位內(nèi)膜黏附、侵襲、血管生成的能力均有明顯差異[10-11]。本研究中EMs患者在位內(nèi)膜同對照組正常內(nèi)膜比較結(jié)果顯示：2組之間同期別內(nèi)膜的MVD、PN均無明顯差異，但在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期，PN/MVD均低于相應(yīng)的正常內(nèi)膜，說明EMs患者的在位內(nèi)膜同正常組相比雖然MVD和PN無明顯不同，但周細胞覆蓋率較低，血管周細胞與內(nèi)皮細胞之間的連接減少，對內(nèi)皮細胞的抑制作用減弱，血管穩(wěn)定性較差，當發(fā)生經(jīng)血逆流時更易在異地發(fā)生細胞遷移、增殖，誘導(dǎo)血管生成，這一結(jié)論同時也佐證了“在位內(nèi)膜決定論”。綜上，周細胞對EMs血管生成有重要作用，參與誘導(dǎo)血管生成啟動、調(diào)節(jié)血管成熟、維持血管穩(wěn)定，周細胞覆蓋率是判定子宮內(nèi)膜血管成熟度和穩(wěn)定性的重要指標。提示以周細胞為靶點調(diào)節(jié)周細胞“正常化”有望成為抗EMs血管生成治療的新途徑。

[1] Ribattid D,Nico B,Crivellato E.The role of pericytes in angiogenesis[J].Int J Dev Biol,2011,55(3):261-268.

[2] Betsholtz C.Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2004,15(4):215-228.

[3] Raza A,Franklin MJ,Dudek AZ.Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis[J].Am J Hematol,2010,85(8): 593-598.

[4]Somani RR,Bhanushali UV.Targeting angiogenesis for treatment of human cancer[J].Indian J Pharm Sci,2013,75(1):3-10.

[5]Ribatti D,Crivellato E.“Sprouting angiogenesis”,a reappraisal[J]. Dev Bio,2012,372(2):157-165.

[6]Rocha AL,Reis FM,Taylor RN.Angiogenesis and endometriosis[J]. Obstet Gynecol Int,2013,2013:859619.

[7]Laschke MW,Giebels C,Menger MD.Vasculogenesis:a new piece of the endometriosis puzzle[J].Hum Reprod Update,2011,17(5):628-636.

[8] 高桂芹,林琬君,李寶森.子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中細胞因子RANTES的測定[J].天津醫(yī)藥,2013,41(7):654-657.

[9] Liu H,Lang JH.Is abnormal eutopic endometrium the cause of endometriosis?The role of eutopic endometrium in pathogenesis of endometriosis[J].Wed Sci Monit,2011,17(4):92-99.

[10]Wang D,Chen Q,Zhang C,et al.DNA hypomethylation of the COX-2 gene promoter is associated with up-regulation of its mRNA expression ineutopic endometrium of endometriosis[J].EurJMed Res,2012,17:12.doi:10.1186/2047-783X-17-12.

[11]Delbandi AA,Mahmoudi M,Shervin A,et al.Eutopic and ectopic stromal cells from patients with endometriosis exhibit differential invasive,adhesive,and proliferative behavior[J].Fertil Steril,2013,100(3): 761-769.

（2013-09-02收稿 2013-12-23修回）

（本文編輯 李國琪）

Roles of Pericyte in the Angiogenesis of Endometriosis

ZHAO Caiyun,YIN Lirong,SUN Junjie
Department of Gynaecology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective To study the expression of pericyte and the association between pericyte and angiogenesis in the endometriosis.Methodsthe endometriosis group is consisted of 20 ectopic endometrium,20 eutopic endometrium during proliferation phase,20 eutopic endometrium during secretory phase of patient with endometriosis.The control group (non-endometriosis)include 20 normal endometrium during proliferation phase and 20 normal endometrium during proliferation phase of women without entometriosis.The histological morphology parameters such as mean density of microvessel (MVD),pericytes number（PN）as well as the average ratio of pericyte to endothelial cells in microvessels were measured by immunohistochemical and morphological assesses.ResultsThe expression of MVD was lower in the normal endometrium and eutopic endometrium compared with it in ectopic endometrium tissue.The difference of the MVD among the different groups was statistical significant(P＜0.05).The expression of MVD in secretory phase endometrium was higher than it in proliferative phase endometrium(P＜0.05),and it shows no significant difference between eutopic endometrium and normal endometrium.The expression of PN and PN/MVD in ectopic and eutopic endometrium in EMs group were lower than those in control group.However,we also found that the difference of PN and PN/MVD was not statistically significant.ConclusionPericytes play an important role in angiogenesis of the endometriosis,and pericyte coverage contribute to maturing of functional vasculature of endometriosis.

endometriosis;neovascularization,physiologic;pericytes;immunohistochemistry;density of microvessel;angiogenesis

R711.71

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.008

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦科（郵編300211）

△通訊作者 E-mail:yinlirongfk@sina.com