暢 昶 徐美林 王 菁

鞘氨醇激酶1和核因子-κB p65在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

暢 昶1徐美林2Δ王 菁2

目的 探討鞘氨醇激酶1（SPHK1）和核因子（NF）-κB在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)及其與NSCLC浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。方法選取93例外科手術(shù)切除并經(jīng)常規(guī)組織學(xué)檢查確診為NSCLC的標(biāo)本和癌旁正常的余肺組織，應(yīng)用免疫組化SP法，一抗分別為兔抗人SPHK1，NF-κB p65抗體，二抗為快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，檢測石蠟切片的NSCLC組織SPHK1和NF-κB的表達(dá)情況。結(jié)果SPHK1和NF-κB在NSCLC組織中的陽性率分別為96.8%（90/93）和89.2%(83/93)，均高于其在正常肺組織中的陽性率18.3%（17/93），12.9%(12/93)。SPHK1和NF-κB在NSCLC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.464，P＜0.01）。TNM分期越高，SPHK1和NF-κB p65高表達(dá)比例就越高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的SPHK1和NF-κB p65高表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；死亡者的SPHK1和NF-κB p65高表達(dá)率高于存活者，生存分析顯示SPHK1高表達(dá)組患者的生存時間短于SPHK1低表達(dá)組的生存時間（χ2=14.025，P＜0.01）。結(jié)論SPHK1可能通過NF-κB在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用，并可能成為提示NSCLC患者預(yù)后并進(jìn)行靶向治療的指標(biāo)。

癌，非小細(xì)胞肺；NF-κB；免疫組織化學(xué)；預(yù)后；鞘氨醇激酶1；非小細(xì)胞肺癌

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)生率和病死率均呈上升趨勢。目前盡管應(yīng)用了各種先進(jìn)的診斷、治療措施，但肺癌的療效數(shù)十年來無明顯提高，五年生存率僅有10%～15%，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是影響肺癌預(yù)后的主要因素。鞘氨醇激酶1（SPHK1）是一種鞘氨醇的代謝酶，在腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要的作用。核因子（NF）-κB是細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞的黏附和移動及其移動后腫瘤細(xì)胞局部的血管形成等諸多環(huán)節(jié)均起重要作用。有研究證實SPHK1、NF-κB在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并且影響患者的預(yù)后[1-2]。然而在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，SPHK1和NF-κB的表達(dá)與轉(zhuǎn)移、預(yù)后之間的關(guān)系并不明確。本研究通過檢測SPHK1和NF-κB在NSCLC組織及正常肺組織中的表達(dá)，觀察其與NSCLC臨床病理之間的關(guān)系，進(jìn)一步驗證SPHK1和NF-κB對NSCLC的生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津市胸科醫(yī)院2009年1月—12月NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本93例，所有病例均經(jīng)過病理證實，術(shù)前均未經(jīng)過放療、化療等相關(guān)治療。其中男60例，女33例。年齡43～82歲，中位年齡62歲。隨訪日期2009年1月，截止日期2012年8月，生存期從手術(shù)日期截止到隨訪日期，或截止到由于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡的日期。鱗癌45例，腺癌36例，腺鱗癌12例。低分化52例，中分化32例，高分化9例。TNM分期，Ⅰ期58例，Ⅱ期16例，Ⅲ期19例。

1.2 方法 選取外科手術(shù)切除并經(jīng)常規(guī)組織學(xué)檢查確診為NSCLC的標(biāo)本和癌旁正常的余肺組織，經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片5～6張，每張厚度5 μm，免疫組化采用SP兩步法，一抗兔抗人SPHK1抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，稀釋為1∶200，一抗NF-κB p65抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司，稀釋為1∶100，二抗為快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均購于福建邁新生物技術(shù)有限公司，二甲苯脫蠟，乙醇脫苯，3%的H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，使用檸檬酸高壓修復(fù)法修復(fù)，一抗水浴1 h，二抗水浴20 min DAB染色，蘇木素復(fù)染，封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)染色方法和結(jié)果判定參考文獻(xiàn)[3]，SPHK1和NF-κB均以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評定和分析：基本不著色者為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的百分比率小于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分；大于51%為3分。將每張切片的染色程度與染色細(xì)胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為中等陽性（++），大于6分為強(qiáng)陽性（+++）。表達(dá)-或+為低表達(dá)組，++～+++為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗，對生存數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank檢驗差異性，采用COX風(fēng)險模型進(jìn)行獨立預(yù)后因素分析，應(yīng)用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPHK1和NF-κB p65的表達(dá) NSCLC組織中SPHK1、NF-κB p65均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色，其陽性率分別是96.8%（90/93）和89.2%(83/93)。在癌旁正常余肺組織中，SPHK1、NF-κB均在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈現(xiàn)黃色，其陽性率分別為18.3%（17/93）和12.9%(12/93)。SPHK1、NF-κB在NSCLC組織中的陽性率均高于其在正常肺組織中的陽性率（χ2分別為117.259和108.459，均P＜0.01）。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，SPHK1和NF-κB在癌旁正常余肺組織中均為低表達(dá)，而在NSCLC組織中部分陽性病例可歸為高表達(dá)，其中高表達(dá)率分別為50.3%（47/93）和47.3%(44/93)，SPHK1和NF-κB的陽性表達(dá)情況在NSCLC組織中呈正相關(guān)，見圖1～3，表1。

2.2 SPHK1和NF-κB p65表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 TNM分期越高，SPHK1和NF-κB p65高表達(dá)比例就越高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的SPHK1和NF-κB p65高表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；死亡者的SPHK1和NF-κB p65高表達(dá)率高于存活者，見表2。

2.3 SPHK1與預(yù)后之間的關(guān)系 高表達(dá)組生存時間低于低表達(dá)組（χ2=14.025，P＜0.01），見圖4。

3 討論

SPHK1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鞘脂代謝的關(guān)鍵酶，其可通過催化神經(jīng)酰胺或鞘氨醇磷酸化產(chǎn)生一磷酸鞘氨醇(S1P)，神經(jīng)酰胺和鞘氨醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然而S1P卻起到相反的作用，通過多種方式來起到抵抗細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺與S1P含量的多少決定了細(xì)胞是凋亡還是增殖[4]，而兩者之間的含量多少則由SPHK1的含量和活性決定。體內(nèi)許多生長因子通過酪氨酸激酶受體（RTKs）激活SPHK1，使其通過磷酸化鞘氨醇而產(chǎn)生更多的S1P，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，細(xì)胞內(nèi)增多的S1P可以進(jìn)一步通過RTKs激活更多的SPHK1，形成一個正反饋的環(huán)路，SPHK1在此環(huán)路中起著重要的作用[5]。S1P可以被轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，以一種自分泌或者旁分泌的方式來刺激它的特異性受體，這個過程被稱為“由內(nèi)而外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”[6]，S1P有5個特異性的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），即：S1P1～5[7]。有研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子3蛋白（STAT3）可以誘導(dǎo)S1P1的表達(dá)，S1P又可以通過S1P1受體激活STAT3，在腫瘤微環(huán)境的形成過程中以及腫瘤惡性化的過程中，STAT3的穩(wěn)定表達(dá)是必要的[8]。S1P還可以上調(diào)Mcl-1，使多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞減少凋亡[9]。在許多惡性腫瘤中都證實了SPHK1的高表達(dá)，例如，有研究證實在結(jié)腸癌組織中SPHK1表達(dá)陽性，正常的黏膜組織為陰性或弱陽性，高表達(dá)的SPHK1的病例更易轉(zhuǎn)移[10]；食管癌組織中SPHK1高表達(dá)，高表達(dá)組的患者生存時間低于低表達(dá)組[11]；高表達(dá)的SPHK1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長，侵襲，轉(zhuǎn)移，同時增加了乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的抵抗。在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織中不表達(dá)，非典型增生的組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[12]。

NF-κB是一種可誘導(dǎo)的二聚體核轉(zhuǎn)錄因子，而p50/p65異源二聚體為NF-κB家族的主要形式[13]。NF-κB參與眾多的病理生理學(xué)過程，在許多炎細(xì)胞因子和激素的刺激下，向細(xì)胞核內(nèi)聚集，調(diào)控細(xì)胞因子，趨化因子等基因的表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體細(xì)胞凋亡，腫瘤生長的生物學(xué)功能[14-16]。

有研究表明，在NSCLC組織中，SPHK1是過表達(dá)的，通過PCR可以檢測到NSCLC腫瘤細(xì)胞中SPHK1 mRNA上調(diào)，同樣也可以檢測到上調(diào)的NF-κB，除了NF-κB含量增加外，過表達(dá)的SPHK1還可以增強(qiáng)NF-κB的活性，使用特異性SPHK1的抑制劑SK1-I或者使用特異性的siRNA靶向沉默SPHK1的表達(dá)均可減少細(xì)胞內(nèi)SPHK1和NF-κB的表達(dá)。過表達(dá)SPHK1的細(xì)胞可以抵抗凋亡，在使用阿霉素或多烯紫杉醇誘導(dǎo)過表達(dá)SPHK1的細(xì)胞進(jìn)行凋亡的過程中，如果同時使用NF-κB的抑制劑，過表達(dá)SPHK1的細(xì)胞就會大量凋亡[17]。這就表明SPHK1需要依賴于NF-κB來發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖，抵抗細(xì)胞凋亡的作用，在NSCLC中NF-κB通路對于SPHK1的抗凋亡作用是必需的。NSCLC的進(jìn)展與SPHK1的高表達(dá)有關(guān)，SPHK1的高表達(dá)有助于維持NSCLC細(xì)胞的生存，降低其對凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性。本研究結(jié)果也顯示，SPHK1與NF-κB在NSCLC中的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，兩項指標(biāo)在NSCLC組織中陽性表達(dá)，同時NSCLC的分化程度越低，侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，TNM分期越高，預(yù)后越差，其陽性程度越高。存活患者和死亡患者腫瘤組織中SPHK1表達(dá)的差異性，也進(jìn)一步證實了SPHK1在NSCLC轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮的重要作用。

[1]何琰,張麗芳.SPHK1在人食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(9):2007-2009.

[2]單海霞,黃廣清,蔡紅星,等.SphK1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2012,17(12):1076-1080.

[3] Li J,Guan HY,Gong LY,et al.Clinical significance of sphingosine kinase-1 expression in human astrocytomas progression and overall patient survival[J].Clini Cancer Res,2008,14(21):6996-7003.doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-0754.

[4] Cuvillier O,Pirianov G,Kleuser B,et al.Suppression of ceramidemediated programmed cell death by sphingosine-1-phosphate[J]. Nature,1996,381(6585):800-803.doi:10.1038/381800a0.

[5] Shida D,Takabe K,Kapitonov D,et al.Targeting SphK1 as a new strategy against cancer[J].Current drug targets,2008,9(8):662. doi:10.2174/138945008785132402.

[6] Takabe K,Kim RH,Allegood JC,et al.Estradiol induces export of sphingosine 1-phosphate from breast cancer cells via ABCC1 and ABCG2[J].J Biol Chem,2010,285(14):10477-10486.doi:10.1074/ jbc.M109.064162.

[7] Mutoh T,Rivera R,Chun J.Insights into the pharmacological relevance of lysophospholipid receptors[J].Br J Pharmacol,2012,165 (4):829-844.doi:10.1111/j.1476-5381.2011.01622.x.

[8] Lee H,Deng J,Kujawski M,et al.STAT3-induced S1PR1 expression is crucial for persistent STAT3 activation in tumors[J].Nat Med,2010,16(12):1421-1428.doi:10.1038/nm.2250.

[9] Li QF,Wu CT,Guo Q,et al.Sphingosine 1-phosphate induces Mcl-1 upregulation and protects multiple myeloma cells against apoptosis[J].Biochemi Biophy Res Commun,2008,371(1):159-162.doi:10.1016/j.bbrc.2008.04.037.

[10]蘇穎潔,黃杰安,劉詩權(quán),等.鞘氨醇激酶1和核因子κB p65在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中華內(nèi)科雜志,2012,51(3): 220-224.doi:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2012.03.012.

[11]Pan J,Tao Y F,Zhou Z,et al.An novel role of sphingosine kinase-1(SPHK1)in the invasion and metastasis of esophageal carcinoma [J].J Transl Med,2011,9:157.doi:10.1186/1479-5876-9-157.

[12]張毅,周艷,王妹妹,等.鞘氨醇激酶1在乳腺不典型增生及乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].中華乳腺病雜志(電子版),2010,4(2):50-52.doi:10.3969/j.issn.1674-0807.2010.02.014.

[13]Rothwarf D M,Karin M.The NF-kappa B activation pathway:a paradigm in information transfer from membrane to nucleus[J].Sci STKE,1999,1999(5):RE1.doi:10.1126/stke.1999.5.re1.

[14]Hayden M S,Ghosh S.Shared principles in NF-κB signaling[J]. Cell,2008,132(3):344-362.doi:10.1016/j.cell.2008.01.020.

[15]Vallabhapurapu S,Karin M.Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system[J].Ann Rev Immunol,2009, 27:693-733.doi:10.1146/annurev.immunol.021908.132641.

[16]Bidère N,Ngo VN,Lee J,et al.Casein kinase 1&agr;governs antigen-receptor-induced NF-&kgr;B activation and human lymphoma cell survival[J].Nature,2008,458(7234):92-96.doi:10.1038/nature07613.

[17]Song L,Xiong H,Li J,et al.Sphingosine Kinase-1 Enhances Resistance to Apoptosis through Activation of PI3K/Akt/NF-κB Pathway in Human Non-Small Cell Lung Cancer[J].Clin Cancer Res, 2011,17(7):1839-1849.doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-0720.

（2013-08-07收稿 2014-01-02修回）

（本文編輯 魏杰）

Expression Level of Sphingosine Kinase 1 and Nuclear Factor-κB p65 in Non-Small Cell Lung Cancer and Their Relationship with Tumor Prognosis

CHANG Chang1,XU Meilin2，WANG Jing2
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Pathology,Tianjin Chest Hospital

ObjectiveTo investigate expression level of sphingosine kinase 1(SPHK1)and nuclear factor-κB(NF-κB)in non-small cell lung cancer(NSCLC)and their relationships with invasion,metastasis and prognosis of NSCLC.MethodsNinety-three NSCLC specimens and paraneoplastic normal lung tissue from conventional surgery were confirmed by histology.Expression of SPHK1 and NF-κB were detected by Immunohistochemistry on paraffin sections.Primary antibody were Rabbit Anti-Human SPHK1 and Rabbit Anti-Human NF-κB p65,which were incubated 1 hour in water bath.The secondary antibody was HRP-Polymer anti Mouse IgG,which was incubated 20 minutes in water bath.ResultsSPHK1 expression was positive in 96.8%(90/93)of NSCLC specimen which is higher than in paraneoplastic normal lung tissue in which the positive rate is 18.3%(17/93);NF-κB expression was positive in 89.2%(83/93)NSCLC which is higher than the in paraneoplastic normal lung tissue in which the positive rate is 12.9%(12/93).The expression of SPHK1 and NF-κB in NSCLC was positively correlated(r=0.464,P＜0.01).TThe expression levels of SPHK1 and NF-κB p65 in NSCLC patients with were positively related to TNM staging and lymph node metastasis.SPHK1 expression and NF-κB p65 expression level were higher in the deads than in survivals.There was no statistical significance in different expression intensity of SPHK1 and NF-κB p65 in patients with NSCLC who had differences in gender,age,tumor size,tumor location,histological type. Survival analysis showed that survival time of patients of NSCLC with high expression of SPHK1 was shorter than those in the group with low SPHK1 expression,and the difference was statistically significant(χ2=14.025,P＜0.01).ConclusionIn the process of NSCLC invasion and metastasis，SPHK1 may play an important role through NF-κB,and it can predict prognosis of NSCLC patient.Moreover,it will become a potential target for NSCLC target.

carcinoma,non-small-cell lung;NF-kappa B;immunohistochemistry;prognosis;sphingosine kinase 1; NSCLS

R734.2，R365

B

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.005

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2天津市胸科醫(yī)院病理科

△通訊作者 E-mail:meilinxugh@sina.com