范晶晶， 鄭秋闿

(1. 山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室(濰坊學院)， 山東 濰坊 261061；2. 濰坊學院 a. 生物與農業(yè)工程學院； b. 化學化工與環(huán)境工程學院， 山東 濰坊 261061)

0 引 言

“生物技術大實驗”是生物技術專業(yè)重要的一門綜合實驗課程，內容涉及分子生物學、基因工程、微生物發(fā)酵、細胞和組織培養(yǎng)等[1]。在多年來的實驗教學過程中發(fā)現存在的最大問題：雖然實驗涉及的內容比較全，但各實驗相互獨立，缺乏內在的聯系性；另外受到傳統(tǒng)教學方式的束縛，學生主動參與實驗設計少，創(chuàng)新性少，導致學生學習熱不高，教學效果不理想[2-4]。為適應生物技術迅猛發(fā)展的要求，提高實驗教學的效果，將該門實驗進行了改革：調整成為期1周的集中綜合大實驗，教師結合自己主持的課題項目列出實驗題目，由學生自己查找文獻設計實驗方案，以科研論文形式提交實驗報告。改革后的實驗課程設計的思想是兼顧基礎和前沿，把科研中成熟的先進方法和技術充實到教學中，實現了傳統(tǒng)的驗證性實驗向設計性、研究性、綜合性實驗模式的轉變。

本實驗選擇了人子宮內膜癌Ishikawa細胞系為實驗材料，體外易培養(yǎng)，生長速度快，探索半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)[5-6]，在子宮癌細胞中是否有表達，有何作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)， M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊生物公司)，Taq酶、DNA Marker、蛋白Marker(北京天根生化科技有限公司)。引物由上海生工合成。CSD一抗為兔源多克隆抗體，由法國Prof. Tappaz教授(Directeur de Recherche CNRS, INSERM U 433, France)贈送，其余抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。試劑為國產分析純。

1.2 實驗儀器

倒置顯微鏡(Nikon, 美國)，顯微攝影系統(tǒng)(Olympus，日本)，凝膠成像系統(tǒng)(AlphaImager，美國)，低溫離心機(Eppendorf，德國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，垂直電泳槽和蛋白轉印(BioRad, 美國)。

1.3 方 法

1.3.1Ishikawa細胞培養(yǎng)與傳代

用含10%胎牛血清，100U/ml的青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)Ishikawa細胞。取對數生長期的Ishikawa細胞待用。細胞傳代用PBS洗兩遍，加入1ml 0.25%胰酶-0.53mmol/L EDTA，37℃消化3 min，加入3 mL有血清培養(yǎng)液終止消化，并計數細胞，按1×105/mL接種細胞到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，每周傳代2次。

1.3.2免疫細胞化學檢測CSD在Ishikawa細胞中的表達

培養(yǎng)的Ishikawa細胞用預冷的PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，3%的H2O2封閉30 min，用10%羊血清濕盒內封閉40 min，添加CSD一抗工作液(1∶1 500)，置于濕盒內4℃孵育過夜。次日取出用生物素標記的羊抗兔的IgG(GAR-B，1∶150)孵育2 h，加稀釋好的辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素(SP-HRP，1∶200)孵育2 h，最后用DAB顯色，蘇木精進行復染，中性樹脂封片，每次滴加抗體前都用PBS漂洗3次。鏡下見胞質為棕黃色者為陽性染色。陰性對照一抗為兔血清，對照組和實驗組處理過程相同，顯微成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3RT-PCR檢測CSD在Ishikawa細胞中表達

參照《精編分子生物學實驗指南》中的方法[8]。吸掉細胞培養(yǎng)液，每個60 mm培養(yǎng)皿加入1 mL Trizol試劑，按照RNA提取說明書進行操作，紫外分光光度計測定RNA濃度。用Oligo dT合成cDNA第一條鏈，特異性引物用于PCR。取2 μg RNA樣本，加入Oligo dT(Promega，美國)2 μL，用DEPC水補至10 μL。65℃水浴5 min,冰上驟冷2～5 min后短暫離心，依次加入M-MLV 5×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，RNAsin 1 μL，M-MLV 1 μL，加滅菌DEPC水4 μL終體積為25 μL，用槍頭小心混勻，42℃水浴60 min，-20℃保存待用。取3 μL反轉錄產物cDNA加至PCR反應體系中，引物(見表1)各1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taqase 1 μL，H2O 35 μL，反應總體積為50 μL。PCR反應體系為：10 ×Buffer 5 μL;dNTP 4 μL;Taq DNA聚合酶1 μL;cDNA第一鏈3 μL;上游引物1 μL;下游引物1 μL;ddH2O 35 μL。條件為：94℃，5 min，然后進入35個循環(huán)，每個循環(huán)包括：94℃變性30 s，52℃退火20 s，72℃延伸30 s。循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，AlphaImager凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。內標基因選擇β-actin，小鼠肝臟組織擴增產物為CSD陽性對照。

表1 RT-PCR基因擴增引物

1.3.4WesternBlot檢測CSD在Ishikawa細胞中的表達

參照《冷泉港蛋白質組學實驗手冊》中的方法[9]。胰酶消化收集Ishikawa細胞，每個60 mm培養(yǎng)皿加入100 μL TEDGM細胞裂解液，勻漿后液氮反復凍融3次，4℃， 13 000 r/min離心5 min，收集上清。蛋白定量按BCA試劑盒說明書操作。將提取到的蛋白按200 μg總蛋白/泳道上樣，進行SDS-PAGE電泳。依據預染蛋白Marker所示范圍切取凝膠。將膠上已分離開的蛋白按電轉印的標準方法轉移到PVDF膜。轉膜后用5%脫脂奶封閉。將一抗CSD和內參GAPDH作1∶5 000和1∶20 000稀釋后分別與膜在4℃條件下孵育過夜。用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(1∶5 000)分別與CSD和GAPDH(內參)膜在常溫下育孵2 h后，用5 mL堿性磷酸酶的底物NBT/BCIP進行顯色約10 min，用自來水沖洗終止反應。小鼠肝臟組織為CSD陽性對照。

2 結果與分析

2.1 細胞培養(yǎng)結果

用倒置顯微鏡觀察Ishikawa細胞，培養(yǎng)的細胞形狀不規(guī)則，大小不等，核比例大，呈單層貼壁、生長，排列緊密，密度增加時見堆積現象(見圖1)。

圖1 Ishikawa細胞培養(yǎng)結果

2.2 免疫細胞化學檢測結果

免疫細胞化學結果顯示CSD在Ishikawa細胞中有表達，CSD在陽性細胞的細胞漿中表達(圖2(a))，呈棕褐色，但在有些細胞中只有微弱的表達。陰性對照(圖2(b))中，用未免疫的兔血清代替一抗，呈陰性反應。

(a)棕色為陽性表達;蘭色為細胞核復染結果(b)對照PBS代替一抗免疫染色

圖2 CSD在Ishikawa細胞的免疫細胞化學檢測結果

2.3 PCR擴增結果

RT-PCR電泳結果(見圖3)顯示，從Ishikawa細胞中獲得的CSD PCR產物和預期擴增產物大小一致，約279bp，與肝臟中擴增片段大小一樣。從這個結果可以得出，Ishikawa細胞和肝臟一樣都有CSD mRNA表達，但表達量低于肝臟中。

1-DNA Marker, 2-Ishikawa細胞CSD擴增產物，3-肝臟擴增產物(陽性對照)圖3 PCR電泳檢測結果

2.4 Western Blot檢測結果

Western Blot結果顯示，Ishikawa細胞和肝臟(陽性對照)中檢測到了CSD蛋白，都得到了預期的大小為53 kDa的蛋白條帶(見圖4)，但表達量肝臟高于Ishikawa細胞。

圖4 Western Blot 分析CSD蛋白在Ishikawa細胞中的表達

3 結 語

生物技術是21世紀最具發(fā)展前景和活力的學科之一[10]，《國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要(2006—2020年)》將其列為需要大力發(fā)展的前沿技術[11]，在《“十二五”生物技術發(fā)展規(guī)劃》中，也將生物技術產業(yè)提到了戰(zhàn)略性新興產業(yè)的歷史新高度[12]。在生物技術呈現迅猛發(fā)展，新理論、新技術層出不窮的背景下，實驗教學培養(yǎng)出的人才質量越發(fā)重要。

生物技術大實驗經過改革，將原有由不同課程間“孤立式”單一的驗證性實驗教學方法轉換為“鏈接式”綜合實驗的新模式[13]。在實驗內容上涉及細胞工程、免疫細胞化學、SDS-Page、Western Blot、RNA提取、RT-RCR等，是學生3年所學的基礎和專業(yè)知識綜合應用的檢驗。這種實驗教學模式很好的培養(yǎng)了他們的創(chuàng)新意識、團隊協(xié)作精神和嚴謹的科學態(tài)度[13-15]。

本實驗涉及CSD基因在Ishikawa細胞中的表達與檢測，在實驗過程中學生還發(fā)現很多值得研究的內容，如：CSD基因在Ishikawa細胞表達量不一致，在癌細胞與正常細胞中的表達量差異分析，酶活性差異分析等。所以，本實驗還有很多的研究空間。學生可以根據自身的學習興趣和專業(yè)發(fā)展需求，繼續(xù)設計不同的后續(xù)實驗方案，并在此過程中逐步培養(yǎng)其科學探究精神。

[1] 韓兆雪，劉華偉．生物技術綜合大實驗教學探討[J]．現代農業(yè)科技，2011，24：32-33．

HAN Zhao-xue, LIU Hua-wei. Teaching discussion on biotechnology experiment [J]．Modern Agricultural Science and Technology，2011，24：32-33．

[2] 鄒曉葵，陸兆新，沈 昌．微生物及其生物技術教學改革與實踐[J]．中國農業(yè)教育，2007(3)：35-37．

ZOU Xiao-kui, LU Zhao-xin, SHENG Chang．Teaching reform and practice of microorganism and biotechnology [J], China Agricultural Education, 2007(3)：35-37．

[3] 莊蘇星，丁 益，沈萍萍，等．生物技術實驗教學的改革與創(chuàng)新[J]．實驗技術與管理，2007，24(5)：15-17．

ZHUANG Su-xing, DING Yi, SHEN Ping-ping,etal. Reformation and innovation of experimental teaching in biotechnology [J]．Experimental Technology and Management，2007，24(5)：15-17．

[4] 何正波，胡小強，李廷景．《生物技術大實驗》教學改革初探[J]．教育教學論壇，2013，32：39-41．

HE Zheng-bo, HU Xiao-qiang, LI Ting-jing. Teaching reformation research on biotechnology experiment [J]．Education Teaching Forum, 2013，32：39-41．

[5] Oertel W H, Schmechel D E, Weise V K,etal. Comparison of cysteine sulphinic acid decarboxylase isoenzymes and glutamic acid decarboxylase in rat liver and brain[J]. Neuroscience, 1981, 6: 2701-2714.

[6] Wu J Y. Purification and characterization of cysteic acid and cysteine sulfinic acid decarboxylase and L-glutamate decarboxylase from bovine brain[J]. Proc Natn Acad Sci, 1982, 79: 4270-4274.

[7] 李建華．半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)在成年小鼠生殖系統(tǒng)的表達以及雌二醇和孕酮CSD在子宮中表達的調控[D]．北京：中國農業(yè)大學，2005．

[8] 奧斯伯F M，布倫特R．精編分子生物學實驗指南[M]．5版．金由辛，包慧中，趙麗云譯．北京:科學出版社，2008．

[9] 林克A J，拉巴厄J．冷泉港蛋白質組學實驗手冊[M]．曾 明，王恒樑，王斌譯．北京:化學工業(yè)出版社，2012．

[10] 國家中長期科學和技術發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)[Z]．國發(fā)[2005]044號．

[11] “十二五”生物技術發(fā)展規(guī)劃[Z]．國科發(fā)社[2011]588號．

[12] 陳 鵬，武永軍，張大鵬，等．生物技術綜合大實驗開設的實踐與探索[J]．安徽農業(yè)科學，2011，39(36):22874-22876．

CHEN Peng, WU Yong-jun, ZHANG Da-peng,etal. Teaching reformation and practices of comprehensive experiment for biotechnology major [J]．Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(36):22874-22876．

[13] 王孝威，曹 慧．“四層次漸進式”實驗教學模式的探索與實踐[J]．安徽農業(yè)科學，2009，37(34)：17218-17219．

WANG Xiao-wei, CAO Hui. Exploration and practice of a new model of progressive four Levels experimental teaching[J]． Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009，37(34)：17218-17219．

[14] 張以順，黎 茵，陳云鳳．分子生物學實驗的科研型教學模式探索與實踐[J]．實驗室研究與探索，2010,29：237-240．

ZHANG Yi-shun, LI Yin, CHEN Yun-feng. Exploration and practice on scientific research pattern of molecular biology experiment teaching[J]．Research and Exploration in Laboratory, 2010,29：237-240．

[15] 宋曉蕓，馬偉超．擬南芥PKS5 蛋白激酶在大腸桿菌中的克隆及表達[J]．實驗室研究與探索，2013,32：52-55．

SONG Xiao-yun， MA Wei-chao. Clone and Expression of Arabidopsis thaliana PKS5 Protein Kinase 5 in Escherichia coli [J]．Research and Exploration in Laboratory, 2013,32：52-55．