范晶晶， 鄭秋闿

(1. 山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(濰坊學(xué)院)， 山東 濰坊 261061；2. 濰坊學(xué)院 a. 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院； b. 化學(xué)化工與環(huán)境工程學(xué)院， 山東 濰坊 261061)

0 引 言

“生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)”是生物技術(shù)專業(yè)重要的一門綜合實(shí)驗(yàn)課程，內(nèi)容涉及分子生物學(xué)、基因工程、微生物發(fā)酵、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等[1]。在多年來的實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中發(fā)現(xiàn)存在的最大問題：雖然實(shí)驗(yàn)涉及的內(nèi)容比較全，但各實(shí)驗(yàn)相互獨(dú)立，缺乏內(nèi)在的聯(lián)系性；另外受到傳統(tǒng)教學(xué)方式的束縛，學(xué)生主動(dòng)參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)少，創(chuàng)新性少，導(dǎo)致學(xué)生學(xué)習(xí)熱不高，教學(xué)效果不理想[2-4]。為適應(yīng)生物技術(shù)迅猛發(fā)展的要求，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果，將該門實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改革：調(diào)整成為期1周的集中綜合大實(shí)驗(yàn)，教師結(jié)合自己主持的課題項(xiàng)目列出實(shí)驗(yàn)題目，由學(xué)生自己查找文獻(xiàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，以科研論文形式提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。改革后的實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)的思想是兼顧基礎(chǔ)和前沿，把科研中成熟的先進(jìn)方法和技術(shù)充實(shí)到教學(xué)中，實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)向設(shè)計(jì)性、研究性、綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ降霓D(zhuǎn)變。

本實(shí)驗(yàn)選擇了人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料，體外易培養(yǎng)，生長速度快，探索半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)[5-6]，在子宮癌細(xì)胞中是否有表達(dá)，有何作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)， M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊生物公司)，Taq酶、DNA Marker、蛋白Marker(北京天根生化科技有限公司)。引物由上海生工合成。CSD一抗為兔源多克隆抗體，由法國Prof. Tappaz教授(Directeur de Recherche CNRS, INSERM U 433, France)贈(zèng)送，其余抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

倒置顯微鏡(Nikon, 美國)，顯微攝影系統(tǒng)(Olympus，日本)，凝膠成像系統(tǒng)(AlphaImager，美國)，低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，垂直電泳槽和蛋白轉(zhuǎn)印(BioRad, 美國)。

1.3 方 法

1.3.1Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

用含10%胎牛血清，100U/ml的青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞。取對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞待用。細(xì)胞傳代用PBS洗兩遍，加入1ml 0.25%胰酶-0.53mmol/L EDTA，37℃消化3 min，加入3 mL有血清培養(yǎng)液終止消化，并計(jì)數(shù)細(xì)胞，按1×105/mL接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，每周傳代2次。

1.3.2免疫細(xì)胞化學(xué)檢測CSD在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)

培養(yǎng)的Ishikawa細(xì)胞用預(yù)冷的PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，3%的H2O2封閉30 min，用10%羊血清濕盒內(nèi)封閉40 min，添加CSD一抗工作液(1∶1 500)，置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。次日取出用生物素標(biāo)記的羊抗兔的IgG(GAR-B，1∶150)孵育2 h，加稀釋好的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素(SP-HRP，1∶200)孵育2 h，最后用DAB顯色，蘇木精進(jìn)行復(fù)染，中性樹脂封片，每次滴加抗體前都用PBS漂洗3次。鏡下見胞質(zhì)為棕黃色者為陽性染色。陰性對照一抗為兔血清，對照組和實(shí)驗(yàn)組處理過程相同，顯微成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3RT-PCR檢測CSD在Ishikawa細(xì)胞中表達(dá)

參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中的方法[8]。吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)60 mm培養(yǎng)皿加入1 mL Trizol試劑，按照RNA提取說明書進(jìn)行操作，紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。用Oligo dT合成cDNA第一條鏈，特異性引物用于PCR。取2 μg RNA樣本，加入Oligo dT(Promega，美國)2 μL，用DEPC水補(bǔ)至10 μL。65℃水浴5 min,冰上驟冷2～5 min后短暫離心，依次加入M-MLV 5×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，RNAsin 1 μL，M-MLV 1 μL，加滅菌DEPC水4 μL終體積為25 μL，用槍頭小心混勻，42℃水浴60 min，-20℃保存待用。取3 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA加至PCR反應(yīng)體系中，引物(見表1)各1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taqase 1 μL，H2O 35 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。PCR反應(yīng)體系為：10 ×Buffer 5 μL;dNTP 4 μL;Taq DNA聚合酶1 μL;cDNA第一鏈3 μL;上游引物1 μL;下游引物1 μL;ddH2O 35 μL。條件為：94℃，5 min，然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：94℃變性30 s，52℃退火20 s，72℃延伸30 s。循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，AlphaImager凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。內(nèi)標(biāo)基因選擇β-actin，小鼠肝臟組織擴(kuò)增產(chǎn)物為CSD陽性對照。

表1 RT-PCR基因擴(kuò)增引物

1.3.4WesternBlot檢測CSD在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)

參照《冷泉港蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》中的方法[9]。胰酶消化收集Ishikawa細(xì)胞，每個(gè)60 mm培養(yǎng)皿加入100 μL TEDGM細(xì)胞裂解液，勻漿后液氮反復(fù)凍融3次，4℃， 13 000 r/min離心5 min，收集上清。蛋白定量按BCA試劑盒說明書操作。將提取到的蛋白按200 μg總蛋白/泳道上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。依據(jù)預(yù)染蛋白Marker所示范圍切取凝膠。將膠上已分離開的蛋白按電轉(zhuǎn)印的標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶封閉。將一抗CSD和內(nèi)參GAPDH作1∶5 000和1∶20 000稀釋后分別與膜在4℃條件下孵育過夜。用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(1∶5 000)分別與CSD和GAPDH(內(nèi)參)膜在常溫下育孵2 h后，用5 mL堿性磷酸酶的底物NBT/BCIP進(jìn)行顯色約10 min，用自來水沖洗終止反應(yīng)。小鼠肝臟組織為CSD陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

用倒置顯微鏡觀察Ishikawa細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不等，核比例大，呈單層貼壁、生長，排列緊密，密度增加時(shí)見堆積現(xiàn)象(見圖1)。

圖1 Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示CSD在Ishikawa細(xì)胞中有表達(dá)，CSD在陽性細(xì)胞的細(xì)胞漿中表達(dá)(圖2(a))，呈棕褐色，但在有些細(xì)胞中只有微弱的表達(dá)。陰性對照(圖2(b))中，用未免疫的兔血清代替一抗，呈陰性反應(yīng)。

(a)棕色為陽性表達(dá);蘭色為細(xì)胞核復(fù)染結(jié)果(b)對照PBS代替一抗免疫染色

圖2 CSD在Ishikawa細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

RT-PCR電泳結(jié)果(見圖3)顯示，從Ishikawa細(xì)胞中獲得的CSD PCR產(chǎn)物和預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，約279bp，與肝臟中擴(kuò)增片段大小一樣。從這個(gè)結(jié)果可以得出，Ishikawa細(xì)胞和肝臟一樣都有CSD mRNA表達(dá)，但表達(dá)量低于肝臟中。

1-DNA Marker, 2-Ishikawa細(xì)胞CSD擴(kuò)增產(chǎn)物，3-肝臟擴(kuò)增產(chǎn)物(陽性對照)圖3 PCR電泳檢測結(jié)果

2.4 Western Blot檢測結(jié)果

Western Blot結(jié)果顯示，Ishikawa細(xì)胞和肝臟(陽性對照)中檢測到了CSD蛋白，都得到了預(yù)期的大小為53 kDa的蛋白條帶(見圖4)，但表達(dá)量肝臟高于Ishikawa細(xì)胞。

圖4 Western Blot 分析CSD蛋白在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)

3 結(jié) 語

生物技術(shù)是21世紀(jì)最具發(fā)展前景和活力的學(xué)科之一[10]，《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006—2020年)》將其列為需要大力發(fā)展的前沿技術(shù)[11]，在《“十二五”生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》中，也將生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)提到了戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的歷史新高度[12]。在生物技術(shù)呈現(xiàn)迅猛發(fā)展，新理論、新技術(shù)層出不窮的背景下，實(shí)驗(yàn)教學(xué)培養(yǎng)出的人才質(zhì)量越發(fā)重要。

生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)經(jīng)過改革，將原有由不同課程間“孤立式”單一的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法轉(zhuǎn)換為“鏈接式”綜合實(shí)驗(yàn)的新模式[13]。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上涉及細(xì)胞工程、免疫細(xì)胞化學(xué)、SDS-Page、Western Blot、RNA提取、RT-RCR等，是學(xué)生3年所學(xué)的基礎(chǔ)和專業(yè)知識綜合應(yīng)用的檢驗(yàn)。這種實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式很好的培養(yǎng)了他們的創(chuàng)新意識、團(tuán)隊(duì)協(xié)作精神和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)涉及CSD基因在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)與檢測，在實(shí)驗(yàn)過程中學(xué)生還發(fā)現(xiàn)很多值得研究的內(nèi)容，如：CSD基因在Ishikawa細(xì)胞表達(dá)量不一致，在癌細(xì)胞與正常細(xì)胞中的表達(dá)量差異分析，酶活性差異分析等。所以，本實(shí)驗(yàn)還有很多的研究空間。學(xué)生可以根據(jù)自身的學(xué)習(xí)興趣和專業(yè)發(fā)展需求，繼續(xù)設(shè)計(jì)不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)方案，并在此過程中逐步培養(yǎng)其科學(xué)探究精神。

[1] 韓兆雪，劉華偉．生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)教學(xué)探討[J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011，24：32-33．

HAN Zhao-xue, LIU Hua-wei. Teaching discussion on biotechnology experiment [J]．Modern Agricultural Science and Technology，2011，24：32-33．

[2] 鄒曉葵，陸兆新，沈 昌．微生物及其生物技術(shù)教學(xué)改革與實(shí)踐[J]．中國農(nóng)業(yè)教育，2007(3)：35-37．

ZOU Xiao-kui, LU Zhao-xin, SHENG Chang．Teaching reform and practice of microorganism and biotechnology [J], China Agricultural Education, 2007(3)：35-37．

[3] 莊蘇星，丁 益，沈萍萍，等．生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革與創(chuàng)新[J]．實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2007，24(5)：15-17．

ZHUANG Su-xing, DING Yi, SHEN Ping-ping,etal. Reformation and innovation of experimental teaching in biotechnology [J]．Experimental Technology and Management，2007，24(5)：15-17．

[4] 何正波，胡小強(qiáng)，李廷景．《生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)》教學(xué)改革初探[J]．教育教學(xué)論壇，2013，32：39-41．

HE Zheng-bo, HU Xiao-qiang, LI Ting-jing. Teaching reformation research on biotechnology experiment [J]．Education Teaching Forum, 2013，32：39-41．

[5] Oertel W H, Schmechel D E, Weise V K,etal. Comparison of cysteine sulphinic acid decarboxylase isoenzymes and glutamic acid decarboxylase in rat liver and brain[J]. Neuroscience, 1981, 6: 2701-2714.

[6] Wu J Y. Purification and characterization of cysteic acid and cysteine sulfinic acid decarboxylase and L-glutamate decarboxylase from bovine brain[J]. Proc Natn Acad Sci, 1982, 79: 4270-4274.

[7] 李建華．半胱亞磺酸脫羧酶(CSD)在成年小鼠生殖系統(tǒng)的表達(dá)以及雌二醇和孕酮CSD在子宮中表達(dá)的調(diào)控[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005．

[8] 奧斯伯F M，布倫特R．精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]．5版．金由辛，包慧中，趙麗云譯．北京:科學(xué)出版社，2008．

[9] 林克A J，拉巴厄J．冷泉港蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M]．曾 明，王恒樑，王斌譯．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2012．

[10] 國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)[Z]．國發(fā)[2005]044號．

[11] “十二五”生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃[Z]．國科發(fā)社[2011]588號．

[12] 陳 鵬，武永軍，張大鵬，等．生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)開設(shè)的實(shí)踐與探索[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(36):22874-22876．

CHEN Peng, WU Yong-jun, ZHANG Da-peng,etal. Teaching reformation and practices of comprehensive experiment for biotechnology major [J]．Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(36):22874-22876．

[13] 王孝威，曹 慧．“四層次漸進(jìn)式”實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的探索與實(shí)踐[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(34)：17218-17219．

WANG Xiao-wei, CAO Hui. Exploration and practice of a new model of progressive four Levels experimental teaching[J]． Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009，37(34)：17218-17219．

[14] 張以順，黎 茵，陳云鳳．分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的科研型教學(xué)模式探索與實(shí)踐[J]．實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2010,29：237-240．

ZHANG Yi-shun, LI Yin, CHEN Yun-feng. Exploration and practice on scientific research pattern of molecular biology experiment teaching[J]．Research and Exploration in Laboratory, 2010,29：237-240．

[15] 宋曉蕓，馬偉超．?dāng)M南芥PKS5 蛋白激酶在大腸桿菌中的克隆及表達(dá)[J]．實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2013,32：52-55．

SONG Xiao-yun， MA Wei-chao. Clone and Expression of Arabidopsis thaliana PKS5 Protein Kinase 5 in Escherichia coli [J]．Research and Exploration in Laboratory, 2013,32：52-55．