楊 婷，廖美德，賀玉廣，劉偲嘉，鄭淡鏗

（華南農(nóng)業(yè)大學天然農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣州 510642）

混菌固態(tài)發(fā)酵降解羽毛生產(chǎn)飼料蛋白質(zhì)工藝研究

楊 婷，廖美德*，賀玉廣，劉偲嘉，鄭淡鏗

（華南農(nóng)業(yè)大學天然農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣州 510642）

試驗主要以酵母菌和淡紫擬青霉為發(fā)酵微生物，羽毛粉和麩皮為發(fā)酵底物，采用混菌固態(tài)發(fā)酵方式，探究基質(zhì)初始水分以及麩皮與羽毛粉的比例等因素對飼料蛋白質(zhì)生產(chǎn)的影響。試驗結(jié)果表明，麩皮∶水=1∶1時最適合酵母菌的生長；麩皮∶水=1∶0.8時，最適合淡紫擬青霉的生長。以1∶1的水料比，當麩皮∶羽毛粉=7∶3時，最適合酵母菌的生長；而當麩皮∶羽毛粉=6∶4時，最適合淡紫擬青霉的生長。因此，混菌固體發(fā)酵降解羽毛生產(chǎn)飼料蛋白質(zhì)最佳初始水分是1∶1，麩皮與羽毛比為7∶3。

酵母菌；淡紫擬青霉；固態(tài)發(fā)酵；羽毛；飼料蛋白質(zhì)

近些年來，我國畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分迅速，對于蛋白質(zhì)類飼料的需求量越來越高。目前，我國的蛋白質(zhì)資源主要依靠進口魚粉，但存在一大弊端就是價格較貴，并不能滿足我國需求[1]。因此，開發(fā)新的飼料蛋白質(zhì)資源已經(jīng)是目前研究的熱點之一。家禽屠宰后，羽毛成為廢棄物，并且產(chǎn)量逐年增加，嚴重污染環(huán)境[2]。羽毛中含有豐富的蛋白質(zhì)，一般含量為75%～90%，主要是不易消化的角蛋白，其本身氨基酸不平衡，畜禽對其消化率較低。羽毛經(jīng)過一定處理后，可以破壞其中較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，使得不溶于水的成分分解。我國每年的禽類羽毛產(chǎn)量可以達到70萬t，按50%加工利用作為飼用羽毛粉，出粉率按80%計，則每年可加工羽毛粉約為30萬t。羽毛粉用作飼料不僅能夠降低成本，補充我國飼料蛋白質(zhì)的不足，還能解決環(huán)境污染，變廢為寶[3]。雖然羽毛粉角蛋白結(jié)構(gòu)變得相對松散，但其消化率與大豆、豆粕等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料相比仍有很大差距，這嚴重限制其在畜禽配合飼料中的應(yīng)用。目前，高壓水解羽毛粉在配合飼料中的最大使用量為5%，超量使用會導致動物營養(yǎng)不良，生長發(fā)育受阻[4]。實驗室在篩選羽毛角蛋白降解菌的過程中發(fā)現(xiàn)，淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）PL-HN-16菌株具有良好的角蛋白酶活性[5]。通過角蛋白酶降解羽毛角蛋白，可以顯著提高其消化率[6-7]。因此，本試驗用淡紫擬青霉和酵母菌為混合發(fā)酵微生物，羽毛粉和麩皮為混合發(fā)酵底物，對混菌固態(tài)發(fā)酵初始水分和羽毛粉添加比例進行研究，為羽毛粉和麩皮混菌固態(tài)發(fā)酵開發(fā)新型蛋白飼料提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

淡紫擬青霉菌株（PL-HN-16）和酵母菌菌株：華南農(nóng)業(yè)大學實驗室保存；羽毛粉：廣州康順飼料添加劑廠提供；麩皮：廣州市花鳥魚蟲市場購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 淡紫擬青霉固體種子制備

將淡紫擬青霉接種到PDA固體培養(yǎng)基上，待菌落表面形成大量孢子后，用無菌水反復洗滌孢子，合并洗滌液即為孢子懸液，按添加量的1%加入滅菌后的麩皮固體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h備用。

1.2.2 酵母菌固體種子制備

將酵母菌接種到LB液體培養(yǎng)基上，30℃，180 rpm恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按添加量的1%加入滅菌的麩皮固體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h備用。

1.2.3 初始水分固態(tài)發(fā)酵的影響

以麩皮為發(fā)酵底物，設(shè)置不同初始水分（底物∶水=1∶1.2、1∶1、1∶0.8和1∶0.6），混合均勻后滅菌，分別接入酵母菌固體種子2 g和淡紫擬青霉固體種子2 g，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時觀察并用血球計數(shù)板法計數(shù)[5]。篩選出酵母菌與淡紫擬青霉培養(yǎng)基的麩皮與水分最佳配比后，選擇一個水平同時接種酵母菌和淡紫擬青霉，與同一配比的單一菌發(fā)酵結(jié)果進行比較。

1.2.4 麩皮與羽毛粉的最佳配比探索

試驗設(shè)置3個不同處理，分別是麩皮∶羽毛= 1∶1、3∶2和7∶3，分別接入酵母菌固體種子2 g和淡紫擬青霉固體種子2 g，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時觀察并用血球計數(shù)板法計數(shù)。篩選出酵母菌與淡紫擬青霉培養(yǎng)基的麩皮與羽毛粉的最佳配比后，選擇一個水平同時接種酵母菌和淡紫擬青霉，與同一配比的單一菌發(fā)酵結(jié)果進行比較。

2 試驗結(jié)果

2.1 對酵母菌生長的影響

不同料水比條件下酵母菌的生長曲線見圖1。

圖1 不同料水比條件下酵母菌的生長曲線

由圖1可知，當麩皮與水比例為1∶0.8、1∶1和1∶1.2時酵母菌的生長情況較好，以1∶1的配比為最佳。酵母菌發(fā)酵14 h后，其菌密度開始進入對數(shù)生長期，發(fā)酵約40 h菌密度趨向穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入衰退期。

2.2 對淡紫擬青霉生長的影響

不同料水比條件下淡紫擬青霉的生長曲線見圖2。

圖2 不同料水比條件下淡紫擬青霉的生長曲線

由圖2可見，培養(yǎng)基中麩皮與水的比例為1∶0.8、1∶1和1∶1.2時淡紫擬青霉的生長情況較好，以1∶0.8的配比為最佳。淡紫擬青霉發(fā)酵32 h后，其產(chǎn)孢量開始進入對數(shù)生長期，發(fā)酵約80 h孢子密度趨向穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入衰退期。

2.3 最佳初始水分下混菌發(fā)酵和單菌發(fā)酵的差異

1∶1 的料水比條件下雙菌的生長曲線見圖3。

圖3 1∶1的料水比條件下對雙菌的生長曲線

由圖3可見，酵母菌培養(yǎng)基中，麩皮與水的最佳配比為1∶1，淡紫擬青霉培養(yǎng)基中麩皮與水的最佳配比為1∶0.8，考慮到酵母菌為單細胞真菌，大多以出芽方式進行繁殖，而淡紫擬青霉是以產(chǎn)孢的方式進行繁殖，其繁殖速度遠大于酵母菌，選擇雙菌培養(yǎng)基的配比時應(yīng)該優(yōu)先考慮酵母菌的最佳配比，故選擇1∶1為雙菌培養(yǎng)基的麩皮與水的配比。在料水比1∶1條件下，分別進行酵母菌、淡紫擬青霉、酵母菌與淡紫擬青霉混菌發(fā)酵，用血球計數(shù)板法記錄下不同發(fā)酵時期每g培養(yǎng)基上酵母菌和淡紫擬青霉孢子數(shù)量。由圖3可見，在料水比1∶1條件下，酵母菌混菌條件下生長比單菌條件下生長要好；淡紫擬青霉混菌培養(yǎng)時，發(fā)酵初期出現(xiàn)頡頏效應(yīng)，酵母菌生長在一定程度上會抑制淡紫擬青霉生長，隨著酵母菌的數(shù)量趨向穩(wěn)定期，淡紫擬青霉的生長速度增加，其生長情況有所改善?？傮w來看，酵母菌與淡紫擬青霉雙菌培養(yǎng)，發(fā)酵初期酵母菌的生長情況優(yōu)于單一酵母菌培養(yǎng)情況，發(fā)酵后期淡紫擬青霉的生長情況優(yōu)于單一淡紫擬青霉培養(yǎng)情況。

2.4 不同配比的麩皮與羽毛對酵母菌生長的影響

不同配比的麩皮與羽毛粉條件下酵母菌的生長曲線見圖4。

圖4 不同配比的麩皮與羽毛粉條件下酵母菌的生長曲線

由圖4可見，用血球計數(shù)板法記錄下不同發(fā)酵時期每g培養(yǎng)基上酵母菌的數(shù)量，繪制出不同配比的麩皮與羽毛粉條件下酵母菌的生長曲線。在培養(yǎng)基中麩皮與羽毛粉的比例為5∶5、6∶4、7∶3時，酵母菌的生長情況差別不大，但以7∶3的配比為最佳。酵母菌發(fā)酵8 h后其菌密度開始進入對數(shù)生長期，發(fā)酵約60 h菌密度趨向穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入衰退期。

2.5 不同配比的麩皮與羽毛對淡紫擬青霉的影響

不同配比的麩皮與羽毛粉條件下淡紫擬青霉的生長曲線見圖5。

圖5 不同配比的麩皮與羽毛粉條件下淡紫擬青霉的生長曲線

由圖5可見，用血球計數(shù)板法記錄不同發(fā)酵時期每g培養(yǎng)基上淡紫擬青霉孢子量，再用淡紫擬青霉的產(chǎn)孢量評價其生長情況，根據(jù)孢子量繪制出不同配比的麩皮與水條件下酵母菌的生長曲線。在培養(yǎng)基中麩皮與羽毛粉的比例為5∶5、6∶4和7∶3時，淡紫擬青霉的生長情況差別不大，但以6∶4配比為最佳。淡紫擬青霉發(fā)酵14 h后其產(chǎn)孢量進入對數(shù)生長期，發(fā)酵約86 h產(chǎn)孢量趨向穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入衰退期。

2.6 最佳麩皮與羽毛的配比對混菌發(fā)酵和單菌發(fā)酵的影響

麩皮與羽毛粉比例為7∶3條件下雙菌的生長曲線見圖6。

圖6 麩皮與羽毛粉比例為7∶3條件下雙菌的生長曲線

由圖6可見，在1∶1的料水比條件下，酵母菌培養(yǎng)以麩皮與羽毛粉的比例為7∶3最佳配比，淡紫擬青霉培養(yǎng)以麩皮與羽毛粉的比例為6∶4最佳配比，考慮到酵母菌為單細胞真菌，大多以出芽的方式進行繁殖，而淡紫擬青霉是以產(chǎn)孢的方式進行繁殖，其繁殖速度遠＞酵母菌，且淡紫擬青霉3組不同配比的發(fā)酵結(jié)果差距較小，故選擇7∶3為雙菌培養(yǎng)基的麩皮與羽毛粉的配比。在含水量50%、麩皮與羽毛粉7∶3條件下，分別接種酵母菌、淡紫擬青霉、酵母菌與淡紫擬青霉，用血球計數(shù)板法記錄下不同發(fā)酵時期每g培養(yǎng)基上酵母菌和淡紫擬青霉孢子數(shù)量，繪制出1∶1的料水比條件下酵母菌和淡紫擬青霉單一培養(yǎng)與共同培養(yǎng)的生長曲線。由圖5可見，在料水比1∶1、麩皮與羽毛粉7∶3條件下，發(fā)酵初期，共同培養(yǎng)的酵母菌與淡紫擬青霉的生長速度均快于單一菌培養(yǎng)。隨著發(fā)酵的進行，共同培養(yǎng)的淡紫擬青霉產(chǎn)孢速度開始低于單一培養(yǎng)，在共同培養(yǎng)的酵母菌密度開始下降時，單一酵母菌仍處于增長期。

3 討論

混菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)，通過混菌固態(tài)發(fā)酵，利用微生物之間的協(xié)同、互補作用，發(fā)揮正組合效應(yīng)，可以提高發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)[8]。麩皮中含有水分12.2%、蛋白質(zhì)14.1%、脂肪3.9%、淀粉53.6%、粗纖維10.5%和灰分5.7%，是常見的飼料來源。具有來源廣、成本低、易加工等優(yōu)點，但直接作為飼料則其營養(yǎng)價值較低[9-10]。通過微生物發(fā)酵，可提高麩皮中的粗蛋白質(zhì)含量，進一步提高麩皮的利用價值。羽毛粉因其所含硬性蛋白質(zhì)而未能得到很好地利用，從而一直被當成廢棄物，污染著生態(tài)環(huán)境。通過生物發(fā)酵，可以將羽毛粉中的蛋白質(zhì)廢物轉(zhuǎn)變?yōu)榭上牡鞍踪|(zhì)和氨基酸，變廢為寶，用于飼料蛋白質(zhì)的生產(chǎn)[11]。淡紫擬青霉（PL-HN-16）所產(chǎn)的角蛋白酶活性較高，具有強二硫鍵還原酶活性，對羽毛降解效果較理想，底物范圍較廣泛，而其本身又非致病菌，且對營養(yǎng)要求不高，因此淡紫擬青霉在羽毛角蛋白降解中具有一定的潛在應(yīng)用價值。角蛋白酶能夠首先打開底物的二硫鍵，使角蛋白的高級結(jié)構(gòu)被破壞，將角蛋白解聚變成單體并進一步將其變?yōu)槔w絲；盡管培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)總濃度不變，但角蛋白解聚后，培養(yǎng)液中的絲蛋白濃度變大，導致培養(yǎng)液出現(xiàn)胨狀物；而后在復合蛋白酶的作用下，將絲蛋白進一步水解為多肽、寡肽和游離氨基酸，這樣就會增加其溶解度，最終呈現(xiàn)液化狀態(tài)。但由于角蛋白的降解機制非常復雜，淡紫擬青霉角蛋白酶的作用機理尚待進一步研究[12]。黃林等研究表明，角蛋白酶是一種復合酶，其中含有特異裂解二硫鍵的二硫鍵還原酶和使多肽水解的多肽水解酶。其降解過程為，二硫鍵還原酶作用于角蛋白二硫鍵，將胱氨酸還原為半胱氨酸，使角蛋白高級結(jié)構(gòu)解體而形成變性角蛋白，變性角蛋白在多肽水解酶作用下逐漸水解成多肽、寡肽和游離氨基酸，由轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生氨氣和硫化物而使角蛋白徹底水解。在角蛋白降解過程中，角蛋白中的硫主要轉(zhuǎn)化成巰基化合物、硫化氫和硫酸鹽3種含硫化合物存在于分解產(chǎn)物中[13]。酵母菌發(fā)酵后的飼料營養(yǎng)豐富，含有多種維生素、礦物質(zhì)、消化酶、促生長因子和氨基酸，適口性極好，是集營養(yǎng)與保健為一體的生物活性添加劑[14]。酵母本身也是一種飼料蛋白，其粗蛋白質(zhì)含量很高，其含量可達干物質(zhì)的50%，從而使單細胞蛋白飼料在畜牧業(yè)被廣泛應(yīng)用[15-16]。

培養(yǎng)基中未添加羽毛粉時，僅由麩皮為雙菌的生長繁殖提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。雙菌發(fā)酵初期出現(xiàn)頡頏效應(yīng)，有限的資源使淡紫擬青霉的生長受到限制。隨著發(fā)酵的進行，在酵母菌的作用下，麩皮中營養(yǎng)性有機物轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)資源[10]，為雙菌的生長補充氮源，也為淡紫擬青霉的生長提供更好的環(huán)境。淡紫擬青霉在發(fā)酵過程中可生產(chǎn)出活性較高的角蛋白酶，對羽毛粉起降解作用[17]。以麩皮和羽毛粉作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)，共同培養(yǎng)酵母菌與淡紫擬青霉。發(fā)酵初期，由于競爭作用，雙菌的生長狀況均優(yōu)于單一菌培養(yǎng)。隨著發(fā)酵的進行，氮源等代謝產(chǎn)物富集，碳源、氧氣等營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，雙菌的生長速度開始低于單一菌培養(yǎng)的速度。從生長曲線來看，酵母菌與淡紫擬青霉之間有一定的競爭性頡頏效應(yīng)。淡紫擬青霉發(fā)酵羽毛粉時，產(chǎn)出游離氨基酸等有機氮源的同時也會產(chǎn)出氨氣等無機氮源。與酵母菌共同培養(yǎng)，酵母菌可以消耗部分無機氮源[18]。同時發(fā)酵麩皮，起到改善氣味、增加蛋白質(zhì)的作用。從發(fā)酵產(chǎn)物來看，酵母菌與淡紫擬青霉之間存在一定的互補協(xié)同效應(yīng)。

4 結(jié)論

本試驗對酵母菌與淡紫擬青霉混菌固態(tài)發(fā)酵的條件進行探究，得出麩皮與羽毛粉的配比為7∶3，底物與水比為1∶1時，淡紫擬青霉與酵母菌共同作用更有利于將難消化的羽毛角蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成更易吸收的優(yōu)質(zhì)飼料蛋白質(zhì)，為我國飼料蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用提供可行性方法。

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Producing Feed Protein with Feather Degradation Fermented in a Solid State by Mixed Cultures

YANG Ting,LIAO Meide*,HE Yuguang,LIU Sijia,ZHENG Dankeng

（Key Laboratory of Natural Pesticide Chemical Biology,Ministry of Education,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

This study took yeast and Paecilomyces lilacinus as mixed fungus,feather and wheat bran as mixed substrate to carry on solid state fermentation,explored the effects of fermentation conditions of substrate moisture,pro?portion of feather and wheat bran on fermentation products.The results showed that wheat bran∶water=1∶1 was most suitable for the growth of yeast;1∶0.8 was most suitable for the grawth of Paecilomyces lilacinus.With 1∶1 water mate?rial ratio,when wheat bran∶feather7∶3,it was most suitable for the growth of yeast;when wheat bran∶feather=6∶4,it was most suitable for the growth of Paecilomyces lilacinus.In conclusion,the optimum raw material fermentation condi?tionsaresubstratemoisture1∶1andwheatbran∶feather=7∶3.

yeast;Paecilomyces lilacinus;solid state fermentation;feather;feed protein

S816.48

A

1001-0084（2014）12-0001-05

2014-10-30

廣州市科技局項目（2008J1-C221）

楊婷（1990-），女，湖北孝感人，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物。

*通訊作者：副教授，碩士生導師，E-mail:meideliaotg@163.com