宋乃建，郝迪娜

（渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,陜西渭南714000）

六勝肽的固相合成

宋乃建，郝迪娜

（渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,陜西渭南714000）

采用多肽固相合成方法，全程在無(wú)水環(huán)境中，以Fmoc-保護(hù)基保護(hù)的α-氨基酸和氨基樹(shù)脂為原料，經(jīng)N-二異丙基乙胺（DIEA）、六氟磷酸苯駢三唑-1-基-氟基三吡咯烷基（PyBop）、1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽（TBTU）縮合，再用切割試劑把粗品從氨基樹(shù)脂上切下來(lái)，得到目標(biāo)粗肽，最后經(jīng)純化分離得到純度在95%以上的目標(biāo)肽。

六勝肽；多肽固相合成；Fmoc-氨基酸

隨著人們對(duì)多肽類(lèi)物質(zhì)作用的研究，多肽的人工合成日益引起人們的廣泛關(guān)注。1963年，美國(guó)著名生物化學(xué)家Bruce Merrifield發(fā)明了多肽固相合成法，自此之后，這一方法被廣泛的應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)的研究領(lǐng)域，尤其是短肽的合成。固相法合成多肽是多肽合成領(lǐng)域一個(gè)重大的突破，對(duì)化學(xué)、生化、醫(yī)藥、免疫分子微生物學(xué)等領(lǐng)域都起到了巨大的推動(dòng)作用[1]。

六勝肽是由6個(gè)氨基酸組成的多肽，由于它能夠減緩肌肉收縮的力量，讓肌肉放松，減少動(dòng)態(tài)紋的發(fā)生與消除細(xì)紋，因此，該多肽在化妝品行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。芴甲氧羰基（Fmoc）方法是一種多肽固相合成的新方法，該方法是以Fmoc作為α氨基的保護(hù)基，F(xiàn)moc對(duì)酸穩(wěn)定，易與堿作用，可以應(yīng)用堿性化合物作脫保護(hù)劑[2]，與本文的實(shí)驗(yàn)合成方法相符。本文采用Fmoc作為氨基酸的保護(hù)基，將目的肽的第一個(gè)氨基的羧基以共價(jià)鍵的形式與固體載體氨基樹(shù)脂（Rink Amide MBHA Resin）相連，以形成產(chǎn)物Fmoc-Arg（pbf）-Rink Amide MBHA Resin為多肽合成的起點(diǎn)，在載體樹(shù)脂上使要合成的多肽進(jìn)行逐個(gè)延伸縮合接肽反應(yīng)，最終合成ER-6-NH2肽鏈，將其酸解脫去樹(shù)脂可得到目標(biāo)產(chǎn)物的粗品，然后再對(duì)粗品進(jìn)行鑒定和純化可得到最終產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料和試劑

Fmoc-Arg（pbf）-OH（精氨酸）、Fmoc-Gln（trt）-OH（谷氨酰胺）、Fmoc-Met-OH（甲硫氨酸）、Fmoc-Glu（OtBu）-OH（谷氨酸）、AC（乙酸酐：吡啶=2∶1）（A.R.吉爾生化（上海）有限公司）；DIEA（N-二異丙基乙胺）、PyBop（六氟磷酸苯駢三唑-1-基-氟基三吡咯烷基）、TBTU（1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽）、TFA（三氟乙酸）（A.R.吉爾生化（上海）有限公司）；DCM（二氟甲烷）、乙醚、乙腈、乙酸乙酯（A.R.國(guó)內(nèi)市售）；DMF（N,N-二甲基甲酰胺）（上海巴斯夫）；茚三酮、吡啶、DBLK（六氫吡啶）（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；苯酚（重慶北培精細(xì)化工廠）；EDT（1，2-乙二硫醇）（美國(guó)Aldrich公司）。

1.2 主要儀器

SHK-循環(huán)水式多用真空泵（鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），TP-213電子天平C=10d（丹佛儀器（北京）有限公司），DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；工業(yè)氮（上海申中工業(yè)氣體有限公司松氧充裝站）；GL-150B干式恒溫器（江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；LCMS ZQ2000 Waters液質(zhì)聯(lián)用儀（日本）；RJ-TDL-40C臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（無(wú)錫市瑞江儀器分析有限公司）；WH-866旋渦混合器（常州諾基有限公司）；超聲波清洗器（上海易凈超聲波清洗機(jī)廠）；Delta600型液相色譜純化系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 合成路線(xiàn)這是反應(yīng)的第一步，即氨基樹(shù)脂與第一個(gè)氨基酸發(fā)生了脫水縮合反應(yīng)，后面幾個(gè)氨基的反應(yīng)與此相同。

1.3.2 樹(shù)脂的活化稱(chēng)取氨基樹(shù)脂0.3g（合成目的肽為0.1mmol，所用的氨基樹(shù)脂的活度為0.33mmol ·g-1，則所要稱(chēng)取的樹(shù)脂量為0.1/0.33=0.3g）放入反應(yīng)柱里面，然后在反應(yīng)柱里面加入樹(shù)脂高度3倍的DCM，用DCM將樹(shù)脂溶脹30min，以活化待用。

1.3.3 去保護(hù)由于所用的樹(shù)脂采用的是Fmoc合成機(jī)制，所以必須去保護(hù)（Fmoc）使α位上的氨基裸露出來(lái)，以便和下一個(gè)氨基酸上的羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)。先用SHK-循環(huán)水式多用真空泵把反應(yīng)柱中的DCM抽掉，然后加入DMF洗滌反應(yīng)3遍，去除干凈DCM，將洗滌液抽干凈，加入去保護(hù)液（含20% DBLK的DMF溶液）高出樹(shù)脂面1cm，鼓入N2反應(yīng)5min，抽掉去保護(hù)液溶液，用DMF洗滌反應(yīng)1遍，再加入去保護(hù)液反應(yīng)10min，抽掉，用DMF洗6遍（保證DBLK完全清洗掉）。

1.3.4 固相上的接肽反應(yīng)此實(shí)驗(yàn)方法的合成方向是羧基端（C）→氨基端（N），成肽所用的縮合劑為T(mén)BTU、DIEA或PyBop、DIEA的混合液，（投料是按3倍投的，即0.1mmol的樹(shù)脂，投氨基酸的量為0. 1mmol×3=0.3mmol再乘以所要接氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量除以1000），反應(yīng)30min（反應(yīng)時(shí)盡量不要使樹(shù)脂漂浮在反應(yīng)液表面）。接上第一個(gè)氨基酸Fmoc-Arg（pbf）-OH,去保護(hù)，然后以此方法依次接氨基酸Fmoc-Arg（pbf）-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu（Otbu）-OH、Fmoc-Glu（Otbu）-OH。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用到氨基酸的情況Tab.1 Conditions of amino acid

1.3.5 AC的反應(yīng)和肽的收縮AC是此條肽鏈的最后一個(gè)成份，在反應(yīng)柱中加入乙酸酐2mL，吡啶1mL，此次反應(yīng)只加入液體縮合劑DIEA，反應(yīng)30min。AC接上后，整條肽的反應(yīng)就完成了，進(jìn)入最后的收縮階段，AC沒(méi)有Fmoc保護(hù)，所以不進(jìn)行去保護(hù)。肽的收縮即：DMF洗滌反應(yīng)3遍，DCM洗滌反應(yīng)3遍，甲醇洗滌反應(yīng)3遍，抽干肽樹(shù)脂。

1.3.6 偶聯(lián)時(shí)的檢測(cè)用滴管取反應(yīng)樹(shù)脂少許（只要檢測(cè)可辨別即可）與小試管中，加少許DMF洗凈，倒掉（不可將樹(shù)脂倒掉），再分別滴加茚三酮3D，50%苯酚3D，吡啶3D后，放入恒溫箱（PV126℃SV127℃）中加熱2.5min，取出觀察溶液及樹(shù)脂是否變色。

1.3.7 ER-6-NH2中樹(shù)脂的切割經(jīng)上述方法合成的六勝肽ER-6-NH2最終需要從樹(shù)脂上切割下來(lái)。切割方法：往50mL圓底燒瓶中倒入5mL切割液（86%TFA+4%苯甲硫醚+5%EDT+3%蒸餾水+2%苯酚）溶液為暗黃色液體，封住燒瓶口放入恒溫（30℃）振蕩器中搖2h。將燒瓶中的液體倒入50mL離心管中，緩慢倒入乙醚，此時(shí)有發(fā)煙現(xiàn)象，封住離心管的口放入RJ-TDL-40C臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（2800r·min-1）中離心2min，倒掉上方渾濁液體。下方為白色固體。再加滿(mǎn)乙醚封口，用旋渦混合器將50mL離心管內(nèi)白色固體振散。放入RJ-TDL-40C臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（2800r·min-1）離心2min。此操作重復(fù)2次。用2mm毛細(xì)玻璃管取少量液體，移入5mL離心管，用膠頭滴管滴入1D乙腈和1D水，放入超聲波清洗器振蕩5s（為了讓其充分溶解）。再放入小型臺(tái)式離心機(jī)離心2min。轉(zhuǎn)速設(shè)定為1200r· min-1。用LCMSZQ-2000 Waters液質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)行檢測(cè)。再將所合成的ER-6-NH2肽粗品半封口狀態(tài)，放入干燥器干燥。

1.3.8 ER-6的鑒定合成的多肽粗品需要質(zhì)譜進(jìn)行鑒定是否含有所需的目標(biāo)產(chǎn)物。本文采用LCMS ZQ-2000 Waters液質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)行檢測(cè)鑒定，通過(guò)質(zhì)譜圖上所得的分子量與理論值的比較來(lái)確定產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹(shù)脂的活化

載體樹(shù)脂上有足夠的位點(diǎn)，能使氨基酸以共價(jià)鍵的形式連在這些位點(diǎn)上。而樹(shù)脂的保存是以干態(tài)保存的，反應(yīng)時(shí)要用有機(jī)溶劑溶脹使其成為濕態(tài)，使這些位點(diǎn)成為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即樹(shù)脂的活化，以便反應(yīng)的充分進(jìn)行。樹(shù)脂的活化程度是根據(jù)其體積的變化來(lái)判斷的，稱(chēng)取的干態(tài)樹(shù)脂是粉末狀的，在有機(jī)溶劑中隨著時(shí)間的增加樹(shù)脂的體積逐漸增大，開(kāi)始漸漸漂浮在有機(jī)溶劑的表面，30min后體積基本不再變化，即樹(shù)脂已經(jīng)活化完全。在固相多肽合成過(guò)程中固相載體樹(shù)脂的溶脹狀況對(duì)縮合試劑及羧基組分的自由擴(kuò)散，對(duì)肽鏈之間的聚集等與縮合反應(yīng)有關(guān)的因素有明顯的影響[5]，樹(shù)脂的溶脹越大，反應(yīng)體系越接近于液相反應(yīng)狀態(tài)，有利于反應(yīng)進(jìn)行。

2.2 多肽鏈的延伸縮合

肽鍵的合成縮合劑有TBTU、PoByp、DIEA，它們有縮合效率高，反應(yīng)速度快，不易發(fā)生消旋化反應(yīng)，且不受氨基酸種類(lèi)限制的優(yōu)點(diǎn)[3，4]。對(duì)同種氨基酸加入不同的縮合劑進(jìn)行反應(yīng)，可得到的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同縮合劑對(duì)同種氨基酸反應(yīng)的影響Tab.2 Effect of different condensation agent on same amino acid

從表2可以看出，使用縮合劑明顯縮短了反應(yīng)的時(shí)間，這樣有利于此肽的工業(yè)生產(chǎn)。

2.3 自由氨基的檢測(cè)

在氨基酸每步合成后需要對(duì)氨基酸的縮合程度進(jìn)行檢測(cè)，保證多肽有較高的合成效率，每次檢測(cè)中，如果結(jié)果是溶液亮黃，樹(shù)脂透明，說(shuō)明已經(jīng)基本上沒(méi)有自由氨基的存在，縮合反應(yīng)完全，可進(jìn)行下個(gè)氨基酸的反應(yīng)。

如果結(jié)果是溶液暗、藍(lán)或者雜，樹(shù)脂呈藍(lán)色、黑色、紅色或者雜，則說(shuō)明仍有自由氨基的存在，縮合不完全，且顏色越深說(shuō)明自由基存在的越多。此時(shí)可能的原因：（1）反應(yīng)時(shí)忘記加液體縮合劑或者縮合劑加少了，給反應(yīng)柱里面加入液體縮合劑，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間15min再次檢測(cè)，直到檢測(cè)溶液亮黃，樹(shù)脂透明；（2）是浮在溶液表面，導(dǎo)致氨基酸和樹(shù)脂不能充分接觸，用攪拌棒輕輕攪拌，攪拌時(shí)攪拌棒不能碰到反應(yīng)柱的底部，使漂浮在有機(jī)溶劑表面的樹(shù)脂融入反應(yīng)液中，保證樹(shù)脂與氨基酸的充分接觸，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間直到檢測(cè)溶液亮黃，樹(shù)脂透明；（3）反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)進(jìn)行的不完全，此時(shí)可以再反應(yīng)段時(shí)間檢測(cè)直到檢測(cè)溶液亮黃，樹(shù)脂透明；原因四是檢測(cè)時(shí)滴加檢測(cè)液不規(guī)范，檢測(cè)時(shí)滴加每種3D要盡量準(zhǔn)確，過(guò)多過(guò)少都會(huì)影響顏色的判斷，再重新取樹(shù)脂進(jìn)行檢測(cè)。如果以上原因都不是導(dǎo)致縮合反應(yīng)不完全的原因，可以抽掉，用DMF洗3遍，換種固體縮合劑重新投料。

2.3.1 時(shí)間對(duì)多肽反應(yīng)的影響反應(yīng)時(shí)間是一個(gè)反應(yīng)的重要部分，它直接影響著一個(gè)反應(yīng)的成敗。表3為本實(shí)驗(yàn)中時(shí)間對(duì)反應(yīng)影響的探討。

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響Tab.3 Effect of reaction time on reaction

由表3可以看出，反應(yīng)在進(jìn)行30min后，時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果已經(jīng)基本沒(méi)有影響，說(shuō)明已基本不存在自由基，可以看作反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行完成。

2.4 接第一個(gè)氨基酸Fmoc-Arg（pbf）-OH的反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)在接第一個(gè)氨基酸Fmoc-Arg（pbf）-OH時(shí)，用的是固體縮合劑TBTU和液體縮合劑DIEA,反應(yīng)后檢測(cè)出溶液亮黃，樹(shù)脂紅。分析原因認(rèn)為液體激活劑加的少了，然后再加入1mmol的DIEA延長(zhǎng)反應(yīng)15min后檢測(cè)，現(xiàn)象同上，這個(gè)原因可以排除。還有原因可能是氨基樹(shù)脂接的第一個(gè)氨基酸不適合用固體縮合劑TBTU，然后抽掉，用DMF洗滌3次，復(fù)投用固體縮合劑PoByp和液體縮合劑DIEA進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果為溶液亮黃，樹(shù)脂透明，接完第一個(gè)氨基酸后，后面的都用縮合劑TBTU和PoByp，反應(yīng)正常完成。

2.5 質(zhì)譜鑒定分析

合成的多肽用質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定，它可以得到合成的多肽的實(shí)際分子量。分析條件是進(jìn)行完切割后，直接對(duì)其進(jìn)行分析。分析所得的質(zhì)譜圖1。

圖1 質(zhì)譜分析鑒定圖Fig.1 Mass chromatogram

由圖1可得到合成多肽的實(shí)際分子量為889.10，此條多肽的理論分子量為889.99，當(dāng)實(shí)際分子量與理論分子量相差在正負(fù)1之間時(shí)，就認(rèn)為所合成的肽為正確的，即兩個(gè)相一致，說(shuō)明合成的即為目的肽的粗品。

2.6 HPLC分析

本文采用Delta600型液相色譜純化系統(tǒng)，色譜分析條件：C18，反相，4.6mm×250mm梯度洗脫梯度從5%A+95%B到30%A+70%B時(shí)間是30min，流速為1.0mL·min-1。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸在100%乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸在100%水。得到見(jiàn)圖2。

圖2 純化多肽的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of purified polypeptide

產(chǎn)物經(jīng)反相高效液相純化后，經(jīng)分析確定最高峰為面積最大峰，即此處為產(chǎn)物可達(dá)到的純度，從圖2可看出，此條肽的純度可達(dá)到95.23%以上。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中氨基酸的縮合劑為T(mén)BTU、DIEA或PyBop、DIEA的混合，有效的提高了縮合效率。合成完全后，切割試劑可有效切除與多肽相連的樹(shù)脂和氨基側(cè)鏈的保護(hù)基，保證了目的肽的得到。切割后得到目標(biāo)肽的粗品，經(jīng)反相高效液相純化后產(chǎn)物的最終純度可達(dá)到95.23%以上，與最初的合成目標(biāo)相符，說(shuō)明此次的合成是有效的。

［1］韓香,顧軍.固相法在多肽合成領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.藥學(xué)進(jìn)展,2002, 28（1）:10-13.

［2］陳心,羅素蘭,張本,等.多肽固相合成的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù), 2006,16（1）:81-82.

［3］白泉,葛小娟,耿信,等.反相液相色譜對(duì)多肽的分離、純化與制備［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào),2002,30（9）:1126-1129.

［4］LI PENG,XU JIE-CHENG.Studies of Novel and Highly Efficient Peptide Coupling.Reagents［J］.Journal ofthe Graduated School of the Chinese AcademyofScience,2004,7（32）:927-929.

［5］Pugh K.C.York E.J.Stewart J.M.,Int.J.Peptide Protein Res.［J］.1992,40（3-4）,208-213.

Synthesis of acetyl hexapeptide-3 with the solid phase method

SONG Nai-jian，HAO Di-na
（College of Chemistry and Life Science,Weinan Normal University,Weinan 714000，China）

Acetyl Hexapeptide-3 was synthesized with alpha amino acids and amino resin protected by fmocbased group,which condensed with DIEA,PyBop,TBTU successivelywith the solid phase peptide synthesis method in whole anhydrous environment.The crude product was cleaved from the amino resin by cleavage agent, then was purified to obtain the target peptide with the purity of 95%.

acetyl hexapeptide-3；solid phase peptide synthesis；Fmoc-amino acid

TQ658

A

1002-1124（2014）10-0073-04

2014-09-11

宋乃建（1979-），男，河南商丘人，碩士研究生，講師，研究方向：化工生產(chǎn)及過(guò)程控制。