楊 政，劉春花，李 晶，馬曉平，黃 偉，鞏 平

肺癌居世界大部分國家腫瘤死亡原因的首位[1]，其中小細胞肺癌(SCLC)占10%～15%。目前,針對SCLC的治療以化療或化放療以及支持治療為主，而SCLC對化療易產(chǎn)生耐藥、易復發(fā)、預后差[2]，近20年來，SCLC的預后改善甚微[3]，中晚期SCLC仍被認為是難以治愈的。目前對SCLC療效的評估主要由腫瘤標志物及影像學變化評定[4]，而這些方法有報道顯示不夠精確[5]，因為沒有好的評估療效指標和復發(fā)預測值，臨床上常存在過度用藥和延誤治療的雙重風險，無法保證患者獲益，故而尋找有效的療效監(jiān)測方法具有重要意義。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指自發(fā)或者由于診療操作而引入外周血的腫瘤細胞，近年來也發(fā)現(xiàn)了CTCs以循環(huán)腫瘤細胞微栓(CTM)的方式存在，且認為CTM對預后的影響更大[6]。與以反映增殖為主的實體瘤的療效評價標準(RECIST)評估方法相比，CTCs更能反映腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲，而轉(zhuǎn)移和侵襲對腫瘤的預后影響更大[5，7]。因此CTCs被認為是最具有臨床應用潛力的新型細胞學標志。在非小細胞肺癌(NSCLC)和SCLC中，CTCs均已經(jīng)被報道是與影像學及腫瘤標記物無關的獨立預后因素[8-9]。但SCLC較NSCLC更易復發(fā)，且CTCs數(shù)量明顯較NSCLC多[10]，這提示在SCLC中CTCs可能有不同于NSCLC的生物學特點。理論上，干預獨立的預后影響因素如CTCs的數(shù)量，會影響到SCLC的預后。本研究通過采用原發(fā)灶的病理學標記進行個體化的檢測和個體化的干預CTCs，評價其對于短期療效的影響，從而為SCLC的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2013年6月石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的45例SCLC患者為研究對象，入組標準為：年齡≥18周歲，Karnofsky功能狀態(tài)評分(KPS)≥70分，預期壽命>3個月，受試前血常規(guī)、肝腎功能、心電圖檢查結(jié)果無異常，依從性好。采用隨機數(shù)字表法分為對照組(23例)和試驗組(22例)，2組患者性別、年齡、分期、治療前KPS、TNM 分期比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)?；颊呔栽负炇鹬橥鈺?。本研究已得到石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并在世界衛(wèi)生組織國際臨床試驗注冊平臺http://www.chictr.org/注冊。由于CTCs采集方法的特殊性，試驗采用邊募集受試者邊試驗的方式進行。設置雙盲對照試驗的方法為：試驗組和對照組在同一病區(qū)治療，彼此信息不對稱；揭盲原則包括：某一組出現(xiàn)明顯的優(yōu)良預后指征或者出現(xiàn)嚴重的毒副作用。

1.2 治療方案 兩組患者均按照美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南指導的化療方案，使用常規(guī)化療藥物治療，于首次化療前及化療周期結(jié)束后檢測外周血CTCs，每2個化療周期后進行全面檢查及療效評估：對照組根據(jù)影像學和血清學評估結(jié)果(RECIST評價[4])決定繼續(xù)按原方案治療或者更換治療方案，完全緩解(CR)：所有目標病灶消失，部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小30%，無變化(SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達進展(PD)，PD：基線病灶長徑總和增加20%或出現(xiàn)新病灶。試驗組根據(jù)CTCs檢測結(jié)果決定按原方案治療或更換治療方案，本課題參考RECIST的評價原理將CTCs數(shù)目評價療效定為7.5 ml。外周血中CTCs數(shù)目全部消失為CR，減少超過30%為PR，上升>25%為PD，介于PR和PD之間為SD[4]。更換的方案治療參考NCCN-SCLC部分并結(jié)合臨床醫(yī)師的判斷。如某次檢測CTCs為0且無影像學表現(xiàn)，即暫不行治療。共進行4個周期化療，2組化療藥物均主要為鉑類和依托泊苷，根據(jù)指南進展后改為吉西他濱單藥。

本研究創(chuàng)新點：

干預循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的研究屬于前沿領域，目前有關其研究的國內(nèi)外報道較少。本課題在小細胞肺癌(SCLC)實施CTCs的臨床干預和動態(tài)監(jiān)測，進一步探討動態(tài)監(jiān)測CTCs在SCLC的臨床治療和發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移中的重要意義，為腫瘤個體化治療提供有力的臨床依據(jù)。隨著腫瘤患病率的不斷增長，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移和減少化療藥使用的盲目性對于腫瘤的治療至關重要，在腫瘤近期療效的判定方面，初步探索了一種從以往瘤灶水平突破到細胞水平的評效方式。強調(diào)患者的主體地位，重視用藥時機的合理化。在決定是否進行原方案化療時，初步探索了一種擺脫以往忽視患者個體隨時變化的給藥時機，及時和靈活地掌控患者的腫瘤負荷水平，調(diào)整用藥方式，本研究在提高SCLC的早期診斷和合理化治療方面得到了突破。

1.3 療效及毒副作用評價 治療2個周期后，45例SCLC患者進行CTCs數(shù)目評價和RECIST評價療效；治療4個周期后，評價兩組療效及客觀緩解率(ORR)、疾病控制率(DCR)，ORR=CR+PR,DCR=CR+PR+SD；隨訪3個周期后，采用KPS評定生活質(zhì)量。

1.4 CTCs的檢測

1.4.1 主要試劑及儀器 免疫磁珠分選系統(tǒng)MiniMACS Starting Kit，德國Meltenyi Biotec公司；Pan-Keratin(C11) Mouse mAb抗體，美國Cell Signaling Technology公司；流式細胞儀FACS Calibur Ⅲ型，美國BD公司；Ficoll人類密度梯度淋巴細胞分離液，北京索萊寶生物公司；異硫氰酸熒光素(fluoresce in isothiocyanate,FITC)標記山羊抗小鼠IgG流式二抗，北京中杉金橋公司；CD56抗體，北京中杉金橋公司。

表1 2組一般資料比較Table 1 Comparison of general informations between the two groups

注：KPS=Karnofsky功能狀態(tài)評分；*為t值

1.4.2 確定每例標本的病理標志資料 從病理科資料庫調(diào)取患者病理或活檢時保存的多種標志連續(xù)染色片，在對于SCLC診斷意義較大的AE1/3、CD56、TTF-1、CgA 4種抗體中選擇陽性率最高者并記錄[11]。

1.4.3 標本采集 嚴格消毒后，應用真空采血針采取肘正中靜脈血，棄去穿刺后的前2 ml靜脈血，采集此后的7.5 ml靜脈血。所有血樣均加入肝素抗凝混勻，并在采集后24 h內(nèi)進行CTCs富集。

1.4.4 CTCs的富集及鑒定 Ficoll密度梯度離心法富集單個核細胞，免疫磁珠陰性分選，流式細胞技術(shù)陽性分選及分析，免疫組化染色鑒定CTCs。各步驟的操作過程遵循廠商規(guī)定的技術(shù)標準。

1.5 CTCs陽性標準 細胞體積>16 μm，核質(zhì)比大于50%，核異性型，核染色質(zhì)濃染。在試驗流程標準下，絕大部分紅細胞、血小板及淋巴細胞可被排除。

1.6 隨訪 隨訪方式以病例跟蹤、門診復查、電話約診為主，以患者疾病確診時間為隨訪起始時間。將失訪病例最后一次隨訪按PD計算。

2 結(jié)果

2.1 CTCs檢出情況 45例SCLC患者首次CTCs檢出37例，陽性率為82%。其中對照組20例(87%)，試驗組17例(77%)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.721，P=0.396)。

2.2 兩種療效評價方式評價SCLC患者療效的結(jié)果 治療2個周期后，45例SCLC患者CTCs變化評價和RECIST評價的療效比較，差異有統(tǒng)計學意義(u=12.210，P=0.011，見表2)。

2.3 治療后兩組治療效果比較 治療4個周期后，對照組與試驗組療效及ORR、DCR比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 兩種療效評價方式評價SCLC患者療效的結(jié)果(例)Table 2 Evaluation of curative effect using two evaluation methods in SCLC patients

注：CR=完全緩解，PR=部分緩解，SD=無變化，PD=進展

表3 兩組治療效果比較(例)Table 3 Comparison of efficacy between the two groups

注：ORR=客觀緩解率，DCR=疾病控制率；*為χ2值

2.4 兩組患者KPS比較 隨訪3個周期后，對照組KPS為(82.1±1.3)分，試驗組為(81.1±1.0)分，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.588，P=0.214)。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移占致死原因的90%[12]，根據(jù)經(jīng)典腫瘤學理論：侵襲、脫落入血是轉(zhuǎn)移的最初階段[13-14]。一系列文獻報道表明，通過CTCs數(shù)目可以預測SCLC患者的化療療效[15]，CTCs能反映患者病情的微觀變化和腫瘤轉(zhuǎn)移的特征，一定程度上反映腫瘤的轉(zhuǎn)移存活率和新宿組織定植能力。而影像學浸潤主要反映腫瘤的原位增殖和營養(yǎng)供應情況，并不一定反映腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。有研究報道，乳腺癌中CTCs的變化和影像學的變化無任何關聯(lián)[16]。并有研究報道，CTCs的變化僅與NSCLC的影像學變化相關，與SCLC的影像學變化無關[17]。本研究45例SCLC患者完成2個周期化療后按CTCs數(shù)目及RECIST做療效評價，結(jié)果提示兩種評效方法有差異，CTCs數(shù)目變化與RECIST評價臨床療效不同步。支持了以往的研究結(jié)論。因此，將全程干預CTCs數(shù)目減少作為治療和用藥的導向，相對于以控制影像學進展作為治療目標的方法，給予腫瘤細胞更充分、游離的藥物接觸環(huán)境，更有可能在一定程度上延緩腫瘤的迅速轉(zhuǎn)移。腫瘤患者的預后受多種因素的影響，少量的CTCs在腫瘤新宿組織定植后，其增生及微環(huán)境情況如“Niche”[18]對化療藥物會產(chǎn)生更強的抵抗力。本研究結(jié)果顯示，試驗組與對照組患者的ORR和DCR不同，這種現(xiàn)象是否是因為CTCs具有同樣的化療藥物抵抗性而降低了新療法的獲益效能，其原因有待進一步探索。試驗組與對照組治療后KPS無差異，提示合理的使用化療干預CTCs，不會增加患者毒副作用和影響生活質(zhì)量，目前還沒有證據(jù)表明在不改變給藥方式和劑量的情況下單以改變常規(guī)化療藥物的給藥時機會造成患者毒副作用增加及生活質(zhì)量的下降。

以往捕獲CTCs的研究中，反復的離心，轉(zhuǎn)移以及流式細胞技術(shù)造成了CTCs數(shù)目的丟失和死亡。為了擴展CTCs的臨床用途和提高檢測率，Matthew等[19]發(fā)展了基于細胞大小和變形性的手段，捕獲了CTCs，并且證實了潛在的體外培養(yǎng)特性及初步檢驗了其對化療藥物的敏感性。Matthew等[19]將CTCs植入了小鼠體內(nèi)，CTCs成功地存活和增殖，進一步證實了CTCs在腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖過程中的意義。盡管CTCs的檢測存在很大的挑戰(zhàn)，探索以細胞增殖和生長規(guī)律為核心的CTCs細胞生物學研究也存在著很多未知。而且CTCs的異質(zhì)性尚有待腫瘤學其他研究領域的進一步發(fā)展。但關于CTCs的研究給腫瘤臨床治療指引了一種新的方向：在腫瘤開始轉(zhuǎn)移之前，靶向于CTCs的治療很有可能改善腫瘤的預后。

SCLC是一種發(fā)病率較低的癌種，本課題由于受到倫理學的限制和模型疾病發(fā)病率的限制，未能開展大規(guī)模、長時間的隨訪，因此尚無法得出多中心、大樣本的數(shù)據(jù)。今后應開展多中心合作，并繼續(xù)對受試者的無進展生存期(PFS)及總生存期(OS)做出探究，以期得出更加中肯的結(jié)論。

1 Gittleman HR,Ostrom QT,Rouse CD,et al.Trends in central nervous system tumor incidence relative to other common cancers in adults,adolescents,and children in the United States,2000 to 2010[J].Cancer,2014.doi:10.1002/cncr.29015.[Epub ahead of print].

2 Riaz SP,Lüchtenborg M,Coupland VH,et al.Trends in incidence of small cell lung cancer and all lung cancer[J].Lung Cancer,2012,75(3):280-284.

3 Zhang Y,He J.The development of targeted therapy in small cell lung cancer[J].J Thorac Dis,2013,5(4):538-548.

4 Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,et al.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline (version 1.1)[J].Eu J Cancer,2009,45(2):228-247.

5 De Giorgi U,Valero V,Rohren E,et al.Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer[J].Ann Oncol,2010,21(1):33-39.

6 Zhang HJ,Wang HY,Zhang HT,et al.Transforming growth factor-beta1 promotes lung adenocarcinoma invasion and metastasis by epithelial-to-mesenchymal transition[J].Mol Cell Biochem,2011,355(1/2):309-314.

7 Budd GT,Cristofanilli M,Ellis MJ,et al.Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(21):6403-6409.

8 Nakamura S,Yagata H,Ohno S,et al.Multi-center study evaluating circulating tumor cells as a surrogate for response to treatment and overall survival in metastatic breast cancer[J].Breast Cancer,2010,17(3):199-204.

9 Hou JM,Krebs M,Sloane R,et al.Molecular features and clinical relevance of circulating tumor cells (CTC) and circulating tumor microemboli (CTM) in patients with small cell lung cancer (SCLC)[J].Clinical & Experimental Metastasis,2011,28(2):221-222.

10 Naito T,Tanaka F,Ono A,et al.Prognostic impact of circulating tumor cells in patients with small cell lung cancer[J].J Thorac Oncol,2012,7(3):512-519.

11 Teng XD.World health Organization classification of tumours,pathology and genetics of tumours of the lung[J].Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi,2005,34(8):544-546.

12 Spano D,Heck C,De Antonellis P,et al.Molecular networks that regulate cancer metastasis[J].Semin Cancer Biol,2012,22(3):234-249.

13 Paget S.The distribution of secondary growths in cancer of the breast.1889[J].Cancer Metastasis Rev,1989,8(2):98-101.

14 Banegas MP,Harlan LC,Mann B,et al.Renal cell cancer:a shift in approaches for treatment of advanced disease in the United States[J].J Natl Compr Canc Netw,2014,12(9):1271-1279.

15 Hou JM,Greystoke A,Lancashire L,et al.Evaluation of circulating tumor cells and serological cell death biomarkers in small cell lung cancer patients undergoing chemotherapy[J].American Journal of Pathology,2009,175(2):808-816.

16 Cardoso F,Saghatchian M,Thompson A,et al.Inconsistent criteria used in American society of clinical oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer[M].United States:J Clin Oncol,2008:2058-2059.

17 Mayer JA,Pham T,Wong KL,et al.FISH-based determination of HER2 status in circulating tumor cells isolated with the microfluidic CEETM platform[J].Cancer Genet,2011,204(11):589-595.

18 Ahmadbeigi N,Soleimani M,Vasei M,et al.Isolation,characterization,and transplantation of bone marrow-derived cell components with hematopoietic stem cell niche properties[J].Stem Cells Dev,2013,22(23):3052-3061.

19 Matthew EM,Gallant JN.Sizing up circulating tumor cells for personalized therapy[J].Cell Cycle,2013,12(15):2346.