潘 坤，張 惠，張澤明，李 崢，楊 衛(wèi)，陳 曄

低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是哺乳動(dòng)物適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與了腫瘤的生長繁殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞凋亡等[1]。HIF-1α蛋白降解的關(guān)鍵步驟是脯氨酰殘基的羥基化，催化此過程的脯氨酰羥化酶(PHD)是整個(gè)過程的限速酶[2]。目前發(fā)現(xiàn)PHD有4種(PHD1、PHD2、PHD3、PHD4)，低氧情況下，PHD3發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用，是否可通過上調(diào)PHD3的表達(dá)，從而降低腫瘤組織中HIF-1α的表達(dá)水平及活性，并進(jìn)一步抑制腫瘤的侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，值得深入研究。本研究旨在通過研究非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織及癌旁正常肺組織中的PHD3表達(dá)情況，及其與HIF-1α蛋白表達(dá)和非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等生物學(xué)特性的關(guān)系，為臨床腫瘤的防治探索新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料收集 收集河北大學(xué)附屬醫(yī)院2010年7月—2012年4月手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本89例，取非小細(xì)胞肺癌組織、癌旁正常肺組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有患者經(jīng)病理確診，術(shù)前未行化療、放療、介入及中藥等抗腫瘤治療，均有完整的病例資料且知情同意。其中男54例，女35例；確診時(shí)年齡37～64歲，中位年齡58歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組)；腫瘤分期(TNM)：Ⅰ期26例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例。臨床分期標(biāo)準(zhǔn)按照第7版美國聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分類。免疫印跡法(Western blotting)檢測所用的腫瘤肺組織及癌旁正常肺組織切除后立即置于-70 ℃冰凍保存。

1.2 研究方法 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，嚴(yán)格按照該公司TRIZOL試劑使用說明書進(jìn)行試驗(yàn)，提取總RNΑ，反轉(zhuǎn)錄后行PCR；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶行吸光度半定量分析。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下：(1)HIF-1α，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s(共32個(gè)循環(huán))，72 ℃延伸10 min。(2)PHD3，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s(共30個(gè)循環(huán))，72 ℃延伸10 min。各檢測指標(biāo)及內(nèi)參照物(β-actin)的引物序列分別為：(1)HIF-1α(433 bp)上游：5′-GCCCCTACTATGTCGCTTTC-3′，下游：5′-GGCCCAAACTAAACTATCTGA-3′；(2)PHD3(337 bp)上游：5′-CCTGATGACATTATCGCCTCT-3′，下游：5′-AGCCTAGCGGTATGCGA-3′；(3)β-actin(635 bp)上游：5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′，下游：5′- CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。

Western blotting：0.1 g肺組織剪碎加入RIPA裂解液后冰浴勻漿，4 ℃ 10 000×g離心，去除沉淀后得到肺組織總蛋白，蛋白樣品稀釋至相同濃度分裝，放置于-80 ℃冷凍保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用微量進(jìn)樣器將等量蛋白質(zhì)樣品加至7.5%SDS-丙烯酰胺凝膠孔中，應(yīng)用200 V電壓電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)保溫過夜，TBST緩沖液沖洗后加入二抗(1∶2 000)室溫雜交1 h，充分漂洗后化學(xué)發(fā)光試劑盒膠片曝光，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度行半定量分析。

1.3 結(jié)果評(píng)定 上海Tanon Gis—2010圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blotting、RT-PCR產(chǎn)物條帶行半定量分析，計(jì)算目的條帶與β-actin的吸光度比值作為相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 PHD3 mRNA和蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，PHD3 mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為(17.8±2.9)，高于癌旁正常肺組織中的(7.1±1.3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.763，P<0.05，見圖1)。 Western blotting結(jié)果顯示，PHD3蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為(13.0±2.8)，低于癌旁正常肺組織中的(20.7±4.2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.391，P<0.05，見圖2)。癌旁正常肺組織及非小細(xì)胞肺癌組織不同臨床分期PHD3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，PHD3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量增高，而PHD3蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。癌旁正常肺組織及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PHD3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PHD3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常肺組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，PHD3蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常肺組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.2 HIF-1α mRNA和蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，HIF-1α mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為(17.2±2.9)，高于癌旁正常肺組織中的(6.5±1.2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.163,P<0.05，見圖1)。Western blotting結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為(20.9±3.8)，高于癌旁正常肺組織的(9.2±1.8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.251，P<0.05，見圖2)。癌旁正常肺組織及非小細(xì)胞肺癌組織不同臨床分期HIF-1α的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，HIF-1α mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。癌旁正常肺組織及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常肺組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 非小細(xì)胞肺癌組織中PHD3 mRNA和蛋白表達(dá)與HIF-1α蛋白表達(dá)的相關(guān)性 非小細(xì)胞肺癌組織PHD3蛋白的表達(dá)與HIF-1α蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.746，P<0.05)；PHD3 mRNA的表達(dá)與HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.792，P<0.05)。

注：C為癌旁正常肺組織，T為非小細(xì)胞肺癌組織；PHD3=脯氨酰羥化酶3，HIF-1α=低氧誘導(dǎo)因子1α
圖1 RT-PCR檢測PHD3、HIF-1α的mRNA表達(dá)水平
Figure1 RT-PCR analysis of PHD3 and HIF-1α mRNA levels

注：C為癌旁正常肺組織，T為非小細(xì)胞肺癌組織
圖2 Western blotting檢測PHD3、HIF-1α的蛋白表達(dá)水平
Figure2 Western blotting analysis of PHD3 and HIF-1α protein levels

表1 癌旁正常肺組織及非小細(xì)胞肺癌組織不同臨床分期PHD3和HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)比較Table 1 Comparison of PHD3，HIF-1α mRNA and protein levels in different clinical stages of lung tissues and adjacent normal lung tissues

注：與癌旁正常肺組織比較，*P<0.05；與非小細(xì)胞肺癌Ⅰ期比較，△P<0.05；與非小細(xì)胞肺癌Ⅱ期比較，☆P<0.05；PHD3=脯氨酰羥化酶3，HIF-1α=低氧誘導(dǎo)因子1α

表2 癌旁正常肺組織及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PHD3和HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)的比較Table 2 Comparison of PHD3，HIF-1α mRNA and protein levels in different groups of lymph node metastasis and adjacent normal lung tissues

注：與癌旁正常肺組織比較，*P<0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，△P<0.05

3 討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)典型特征是腫瘤內(nèi)部組織的局部低氧，HIF-1α是調(diào)控組織細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常氧壓情況下，HIF-1α可通過腫瘤抑制蛋白pVHL介導(dǎo)的泛素蛋白酶體途徑迅速降解；低氧情況下，因HIF-1α羥基化過程受阻，胞質(zhì)內(nèi)HIF-1α積聚增多并轉(zhuǎn)移入核，與HIF-1β結(jié)合形成HIF-1異二聚體，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞代謝和新生血管生成有關(guān)的蛋白表達(dá)并促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，HIF-1α在腫瘤的惡性發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。HIF-1α降解的關(guān)鍵是PHD催化HIF-1α脯氨酰殘基羥基化，而催化此過程的PHD便是全過程的限速酶[3]。國內(nèi)關(guān)于PHD蛋白表達(dá)與HIF-1α調(diào)控的研究主要集中在體外細(xì)胞中進(jìn)行，在人類非小細(xì)胞肺癌組織中是否也存在相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制目前還不明確。本研究通過對(duì)比分析89例非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的PHD3和HIF-1α表達(dá)的差異，闡明PHD3調(diào)控HIF-1α表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生物學(xué)特性的關(guān)系，為腫瘤防治新思路提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PHD3 mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常肺組織，Western blotting結(jié)果顯示PHD3蛋白變化趨勢與其mRNA的變化趨勢相反，即PHD3蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常肺組織。有研究表明低氧可以誘導(dǎo)PHD3 mRNA的表達(dá)[4]，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氧情況下HIF-1α可增加對(duì)PHD3 mRNA的轉(zhuǎn)錄激活，應(yīng)用siRNA抑制HIF-1α的表達(dá)可導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)的PHD3表達(dá)減少，因此HIF-1α蛋白的表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌組織高于癌旁正常肺組織，這可能是導(dǎo)致PHD3 mRNA表達(dá)增高的原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，PHD3 mRNA和蛋白的變化趨勢不相符，非小細(xì)胞肺癌組織中PHD3 mRNA的表達(dá)是升高的，而其蛋白的表達(dá)水平呈下降趨勢，提示非小細(xì)胞肺癌組織中PHD3的表達(dá)可能受某種蛋白水平的調(diào)控，但其具體分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。有研究結(jié)果表明，PHD可能是一種抑癌基因，Su等[5]研究了PHD2在胰腺癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的PHD2表達(dá)要低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，同期的大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PHD2過表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤生長遲緩并抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。Xue等[6]發(fā)現(xiàn)，PHD3蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平下降，并且與腫瘤的分化程度及是否伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制PHD3表達(dá)可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和成瘤性。亦有臨床研究通過檢測大樣本乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)>50%的乳腺癌患者乳腺組織中至少有一種PHD表達(dá)，從側(cè)面提示了PHD作為抑癌基因存在的可能[7]。本研究中PHD3蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常肺組織，同時(shí)PHD3蛋白的表達(dá)在腫瘤不同病理分期各組間亦有差異，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PHD3蛋白表達(dá)低于癌旁正常肺組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，上述結(jié)果均提示PHD3可能作為一種抑癌基因存在，具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛能。

本研究結(jié)果還顯示，HIF-1α在癌旁正常肺組織中有一定表達(dá)，提示即使在正常情況下HIF-1α對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)節(jié)作用也是存在的，雖然在正常氧壓情況下HIF-1α的表達(dá)相對(duì)較少，但對(duì)于生物體的正常細(xì)胞代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還是非常重要的。本研究中非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)均升高，提示其轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均上調(diào)。上調(diào)的HIF-1α表達(dá)一方面可能與腫瘤內(nèi)部組織低氧導(dǎo)致PHD3活性下降有關(guān)，另一方面可能與PHD3的表達(dá)相對(duì)減少從而抑制了HIF-1α經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解有關(guān)。HIF-1α在腫瘤血管形成、腫瘤干細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要作用，目前研究者在大部分腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)HIF-1α的廣泛存在。迄今為止已有多位學(xué)者證實(shí)，在如胃癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白的高表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)水平與腫瘤的病理分期、遠(yuǎn)處侵襲等密切相關(guān)[8-10]，Karetsi等[11]通過免疫組化試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中HIF-1α大量表達(dá)。Song等[12]發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，應(yīng)用漢黃芩素降低HIF-1α的表達(dá)后，可進(jìn)而導(dǎo)致其下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)減少，從而抑制腫瘤組織的血管生成。因此，設(shè)法降低HIF-1α的表達(dá)對(duì)于延緩腫瘤生長、解決化療藥物耐藥性等均有重要意義。

本研究的相關(guān)性分析表明，PHD3蛋白與HIF-1α蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)PHD3 mRNA與HIF-1α蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。由此可推測，在非小細(xì)胞肺癌組織內(nèi)部的低氧微環(huán)境中，PHD3活性降低，同時(shí)其蛋白表達(dá)水平亦下降，導(dǎo)致HIF-1α在組織細(xì)胞中蓄積，增高的HIF-1α反過來激活PHD3的轉(zhuǎn)錄，使PHD3 mRNA表達(dá)增加，與之前在大鼠實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)論相一致[13]。PHD3是調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)和活性的關(guān)鍵物質(zhì)，siRNA抑制PHD3的表達(dá)，低氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)明顯增高，過表達(dá)PHD3則可抑制低氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)。

綜上所述，PHD3調(diào)控HIF-1α表達(dá)可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，能否通過恰當(dāng)途徑上調(diào)腫瘤組織中PHD3的表達(dá)進(jìn)而增加HIF-1α降解成為腫瘤治療新的作用靶點(diǎn)。

1 Yohena T,Yoshino I,Takenaka T,et al.Upregulation of hypoxia-inducible factor-1alpha mRNA and its clinical significance in non-small cell lung Cancer[J].J Thorac Oncol,2009,4(3):284-290.

2 Tian YM,Mole DR,Ratcliffe PJ,et al.Characterization of different isoforms of the HIF prolyl hydroxylase PHD1 generated by alternative initiation[J].Biochem J,2006,397(1):179-186.

3 潘坤,戴愛國,胡瑞成.缺氧誘導(dǎo)因子家族蛋白的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2006,3(1):44-47.

4 Aprelikova O,Chandramouli GV,Wood M,et al.Regulation of HIF prolyl hydroxylases by hypoxia-inducible factors[J].J Cell Biochem,2004，92(3):491-501.

5 Su Y,Loos M,Giese N,et al.Prolyl hydroxylase-2(PHD2)exerts tumor-suppressive activity in pancreatic Cancer[J].Cancer,2012,118(4):960-972.

6 Xue J,Li X,Jiao S,et al.Prolyl hydroxylase-3 is down-regulated in colorectal cancer cells and inhibits IKKbeta Independent of hydroxylase activity[J].Gastroenterology,2010,138(2):606-615.

7 Tan EY,Yan M,Campo L,et al.The key hypoxia regulated gene CAIX is upregulated in basal-like breast tumours and is associated with resistance to chemotherapy[J].The British Journal of Cancer,2009,100(2):405-411.

8 沈承瀾,沈振斌,陳偉東.血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后影響的研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2010,13(8):2460-2463,2466.

9 陶曉峰,劉暢.缺氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子與肝細(xì)胞癌分化及其侵襲性的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2011,14(2):164-166,170.

10 Yoon SY,Lee HR,Park Y,et al.Thymosin β4 expression correlates with lymph node metastasis through hypoxia inducible factor-α induction in breast cancer[J].Oncology Reports,2011,25(1):23-31.

11 Karetsi E,Ioannou MG,Kerenidi T,et al.Differential expression of hypoxia-inducible factor 1α in non-small cell lung cancer and small cell lung cancer[J].Clinics(Sao Paulo),2012,67(12):1373-1378.

12 Song X,Yao J,Wang F,et al.Wogonin inhibits tumor angiogenesis via degradation of HIF-1α protein[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2013,271(2):144-155.

13 陳云榮,戴愛國,胡瑞成.缺氧誘導(dǎo)因子1α與其脯氨酰羥化酶相互調(diào)控對(duì)大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2006,29(10):668-673.