楊新玲，李 杰，盧素玉，王海芳，郝慧瑤，張松筠

瘦素是一種脂肪細(xì)胞分泌的能量平衡調(diào)節(jié)激素，可抑制食欲、增加能量消耗、減輕體質(zhì)量[1]。下丘腦神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一種很強的食欲刺激因子，主要來自下丘腦弓狀核，在攝食行為和能量消耗的整合中起重要作用[2]。NPY神經(jīng)元是瘦素在中樞的作用位點，瘦素可與NPY神經(jīng)元上瘦素受體結(jié)合，抑制NPY合成與分泌[3]，二者形成瘦素-下丘腦NPY軸，調(diào)節(jié)機體能量代謝。

大量研究表明瘦素與肥胖、2型糖尿病密切相關(guān)[4-6]。筆者先前的研究也已經(jīng)證實，在2型糖尿病(正?！葝u素抵抗→2型糖尿病)發(fā)病過程中大鼠血清瘦素水平呈遞增趨勢[7]。但NPY與2型糖尿病關(guān)系的研究還很少，且主要局限于肥胖及2型糖尿病患者[8-9]，2型糖尿病發(fā)生過程中NPY的變化及其與瘦素之間的關(guān)系國內(nèi)外均未見報道。本研究通過觀察在2型糖尿病大鼠模型形成過程中，瘦素、下丘腦NPY水平的變化，探討瘦素-下丘腦NPY軸在2型糖尿病大鼠發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選用清潔級180～220 g雄性SD大鼠110只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 本研究通過改良的高脂飲食加小劑量(15 mg/kg)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)法建立2型糖尿病大鼠模型[10]。采用隨機數(shù)字表法抽取20只作為正常對照組，喂以基礎(chǔ)飼料；90只喂以高脂飼料(在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上加10%豬油和2%膽固醇)，4周時將體質(zhì)量超過正常對照組最高體質(zhì)量的大鼠(60只)納入高脂飲食誘導(dǎo)肥胖(diet-induced obese，DIO)組，余者淘汰，該時間點設(shè)為DIO4W，采用隨機數(shù)字表法選取20只為DIO4W組；其余40只繼續(xù)喂以高脂飼料4周(此時間點設(shè)為DIO8W)，采用隨機數(shù)字表法選取20只為DIO8W組；剩余大鼠腹腔注射小劑量STZ，10 d后測空腹血糖大于正常對照組大鼠均值加3個標(biāo)準(zhǔn)差 (本研究確定該值為7.8 mmol/L)，且空腹血糖>7.8 mmol/L能維持3周者納入2型糖尿病組(20只)。

1.3 空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平測定 采用放射免疫法檢測空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平，實驗大鼠禁食8 h，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，心臟穿刺采血2 ml，4 ℃離心，取血清，檢測瘦素水平；經(jīng)心臟以0.9%氯化鈉溶液灌洗全腦，斷頭取腦，以0.2 mol/L醋酸溶液煮沸10 min以滅活酶，取下丘腦，加入上述醋酸溶液1 ml勻漿，離心，取上清液，檢測NPY水平。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒(北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司)說明書進(jìn)行，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為批內(nèi)變異系數(shù)<10%，批間變異系數(shù)<15%。

1.4 下丘腦NPY mRNA表達(dá)水平測定 采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測下丘腦NPY mRNA的表達(dá)。取下丘腦組織100 mg，迅速將組織置于4 ℃焦碳酸二乙酯(DEPC)水中洗去血液后，置凍存管保存于-80 ℃低溫冰箱中。用Trizol(美國 Invitrogen 公司)提取海馬組織總RNA后，用1.5%含EB的瓊脂糖凝膠鑒定RNA質(zhì)量，用核酸蛋白測定其水平及純度。引物(美國 Invitrogen 公司)序列為：上游： 5′-GCTAGGTAACAAACGAATGGGG-3′； 下游： 5′-CACATGGAAGGGTCTTCAAGC-3′。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃ 45 s、55.5 ℃ 35 s、72 ℃ 45 s(共35個循環(huán))，72 ℃延伸5 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)片段標(biāo)記，以GAPDH電泳條帶作為參照，結(jié)果用RT-PCR擴(kuò)增靶基因產(chǎn)物的表達(dá)水平與GAPDH表達(dá)水平積分吸光度的比值表示。

2 結(jié)果

2.1 4組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平比較 4組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平均高于DIO4W組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2型糖尿病組空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平高于DIO8W組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of fasting serum leptin and hypothalamic NPY levels in the four groups

組別例數(shù)血清瘦素水平(μg/L)下丘腦NPY水平(ng/L)正常對照組200 25±0 04133 5±16 9DIO4W組200 32±0 04?164 9±20 6?DIO8W組200 40±0 03?○199 4±36 9?○2型糖尿病組200 48±0 06?○△255 1±40 8?○△F值87 025270 782P值<0 001<0 001

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與DIO4W組比較，○P<0.05；與DIO8W組比較，△P<0.05

2.2 4組下丘腦NPY mRNA表達(dá)水平比較 正常對照組、DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達(dá)水平分別為(0.85±0.14)、(1.16±0.15)、(1.53±0.14)、(1.79±0.13)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=173.320，P<0.05)。DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達(dá)水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達(dá)水平均高于DIO4W組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2型糖尿病組的NPY mRNA表達(dá)水平高于DIO8W組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 相關(guān)性分析 4組大鼠空腹血清瘦素水平與下丘腦NPY水平、NPY mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.951、0.953，P<0.05)。

3 討論

2型糖尿病作為一種代謝性疾病已成為人類健康的第三大殺手，預(yù)防和治療糖尿病迫在眉睫[11]。瘦素是脂肪細(xì)胞分泌的一種調(diào)節(jié)能量平衡的重要激素，與2型糖尿病發(fā)病密切相關(guān)[12]。瘦素通過與其受體結(jié)合從而發(fā)揮中樞性和外周性生物學(xué)效應(yīng)，在中樞瘦素主要通過下丘腦NPY這個中介物發(fā)揮作用[13-14]。NPY是由下丘腦弓狀核神經(jīng)元分泌和產(chǎn)生的，通過刺激進(jìn)食、抑制產(chǎn)熱和提高胰島素水平來達(dá)到能量平衡[15]。大量動物研究表明，下丘腦的NPY神經(jīng)元上含有瘦素受體，腦室注射瘦素可顯著降低下丘腦NPY mRNA的表達(dá)；血清中瘦素水平減少,能使下丘腦NPY分泌增加，使大鼠出現(xiàn)多食、肥胖和血糖增高[16]。故現(xiàn)在認(rèn)為瘦素與下丘腦NPY構(gòu)成了瘦素-下丘腦NPY軸，參與攝食，影響糖脂代謝。目前對瘦素-下丘腦NPY軸的研究主要局限于肥胖及2型糖尿病患者，而本研究觀察了2型糖尿病發(fā)生過程中NPY的變化及其與瘦素之間的關(guān)系。

本研究顯示，在2型糖尿病大鼠模型形成過程中， DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于正常對照組，DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于DIO4W組， 2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于DIO8W組，提示隨著動物體質(zhì)量的逐漸增加，空腹血清瘦素水平逐漸升高，機體對瘦素的反應(yīng)減弱或無反應(yīng)，即發(fā)生了瘦素抵抗，與張松筠等[10]的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達(dá)水平均高于正常對照組，DIO8W組、2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達(dá)水平均高于DIO4W組， 2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達(dá)水平高于DIO8W組，提示在2型糖尿病大鼠模型形成過程中，下丘腦NPY 水平及NPY mRNA表達(dá)均逐漸增強，且與血清瘦素水平呈正相關(guān)。其可能機制與瘦素抵抗有關(guān)：瘦素的下游信號(如瘦素受體)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)及功能障礙[10]，使其不能正常發(fā)揮生理作用，包括對NPY神經(jīng)元的抑制，于是導(dǎo)致下丘腦NPY 水平上調(diào)。NPY是強效的食欲刺激因子，其表達(dá)上調(diào)可引起大鼠攝食與體質(zhì)量的明顯增加。

總之，隨著2型糖尿病大鼠模型的形成，下丘腦NPY水平及血清瘦素水平顯著升高，提示瘦素-下丘腦NPY軸功能異常，出現(xiàn)瘦素抵抗。瘦素抵抗對NPY神經(jīng)元的抑制減弱，使NPY表達(dá)水平升高，食欲增加，進(jìn)一步促進(jìn)肥胖，加重胰島素抵抗，導(dǎo)致2型糖尿病的形成。但本研究只觀察了上述一種現(xiàn)象，對其具體分子通路方面，還有待進(jìn)一步研究。雖然還不清楚瘦素-下丘腦NPY軸是否為2型糖尿病的致病因素，但對其在2型糖尿病形成中的變化的研究將有助于對糖尿病發(fā)病機制的進(jìn)一步認(rèn)識，并為糖尿病的診斷及治療開辟新的途徑。

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