楊新玲,李 杰,盧素玉,王海芳,郝慧瑤,張松筠
瘦素是一種脂肪細胞分泌的能量平衡調(diào)節(jié)激素,可抑制食欲、增加能量消耗、減輕體質(zhì)量[1]。下丘腦神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一種很強的食欲刺激因子,主要來自下丘腦弓狀核,在攝食行為和能量消耗的整合中起重要作用[2]。NPY神經(jīng)元是瘦素在中樞的作用位點,瘦素可與NPY神經(jīng)元上瘦素受體結合,抑制NPY合成與分泌[3],二者形成瘦素-下丘腦NPY軸,調(diào)節(jié)機體能量代謝。
大量研究表明瘦素與肥胖、2型糖尿病密切相關[4-6]。筆者先前的研究也已經(jīng)證實,在2型糖尿病(正?!葝u素抵抗→2型糖尿病)發(fā)病過程中大鼠血清瘦素水平呈遞增趨勢[7]。但NPY與2型糖尿病關系的研究還很少,且主要局限于肥胖及2型糖尿病患者[8-9],2型糖尿病發(fā)生過程中NPY的變化及其與瘦素之間的關系國內(nèi)外均未見報道。本研究通過觀察在2型糖尿病大鼠模型形成過程中,瘦素、下丘腦NPY水平的變化,探討瘦素-下丘腦NPY軸在2型糖尿病大鼠發(fā)病過程中的作用。
1.1 材料來源 選用清潔級180~220 g雄性SD大鼠110只,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。
1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 本研究通過改良的高脂飲食加小劑量(15 mg/kg)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法建立2型糖尿病大鼠模型[10]。采用隨機數(shù)字表法抽取20只作為正常對照組,喂以基礎飼料;90只喂以高脂飼料(在基礎飼料的基礎上加10%豬油和2%膽固醇),4周時將體質(zhì)量超過正常對照組最高體質(zhì)量的大鼠(60只)納入高脂飲食誘導肥胖(diet-induced obese,DIO)組,余者淘汰,該時間點設為DIO4W,采用隨機數(shù)字表法選取20只為DIO4W組;其余40只繼續(xù)喂以高脂飼料4周(此時間點設為DIO8W),采用隨機數(shù)字表法選取20只為DIO8W組;剩余大鼠腹腔注射小劑量STZ,10 d后測空腹血糖大于正常對照組大鼠均值加3個標準差 (本研究確定該值為7.8 mmol/L),且空腹血糖>7.8 mmol/L能維持3周者納入2型糖尿病組(20只)。
1.3 空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平測定 采用放射免疫法檢測空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平,實驗大鼠禁食8 h,10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后,心臟穿刺采血2 ml,4 ℃離心,取血清,檢測瘦素水平;經(jīng)心臟以0.9%氯化鈉溶液灌洗全腦,斷頭取腦,以0.2 mol/L醋酸溶液煮沸10 min以滅活酶,取下丘腦,加入上述醋酸溶液1 ml勻漿,離心,取上清液,檢測NPY水平。操作過程嚴格按照試劑盒(北京原子高科核技術應用股份有限公司)說明書進行,質(zhì)控標準為批內(nèi)變異系數(shù)<10%,批間變異系數(shù)<15%。
1.4 下丘腦NPY mRNA表達水平測定 采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測下丘腦NPY mRNA的表達。取下丘腦組織100 mg,迅速將組織置于4 ℃焦碳酸二乙酯(DEPC)水中洗去血液后,置凍存管保存于-80 ℃低溫冰箱中。用Trizol(美國 Invitrogen 公司)提取海馬組織總RNA后,用1.5%含EB的瓊脂糖凝膠鑒定RNA質(zhì)量,用核酸蛋白測定其水平及純度。引物(美國 Invitrogen 公司)序列為:上游: 5′-GCTAGGTAACAAACGAATGGGG-3′; 下游: 5′-CACATGGAAGGGTCTTCAAGC-3′。PCR擴增條件:94 ℃預熱5 min,94 ℃ 45 s、55.5 ℃ 35 s、72 ℃ 45 s(共35個循環(huán)),72 ℃延伸5 min。取10 μl PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,以DNA Marker作為標準片段標記,以GAPDH電泳條帶作為參照,結果用RT-PCR擴增靶基因產(chǎn)物的表達水平與GAPDH表達水平積分吸光度的比值表示。
2.1 4組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平比較 4組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平和下丘腦NPY水平均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平均高于DIO4W組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);2型糖尿病組空腹血清瘦素和下丘腦NPY水平高于DIO8W組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。
Table1 Comparison of fasting serum leptin and hypothalamic NPY levels in the four groups
組別例數(shù)血清瘦素水平(μg/L)下丘腦NPY水平(ng/L)正常對照組200 25±0 04133 5±16 9DIO4W組200 32±0 04?164 9±20 6?DIO8W組200 40±0 03?○199 4±36 9?○2型糖尿病組200 48±0 06?○△255 1±40 8?○△F值87 025270 782P值<0 001<0 001
注:與正常對照組比較,*P<0.05;與DIO4W組比較,○P<0.05;與DIO8W組比較,△P<0.05
2.2 4組下丘腦NPY mRNA表達水平比較 正常對照組、DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平分別為(0.85±0.14)、(1.16±0.15)、(1.53±0.14)、(1.79±0.13),差異有統(tǒng)計學意義(F=173.320,P<0.05)。DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);DIO8W組、2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平均高于DIO4W組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);2型糖尿病組的NPY mRNA表達水平高于DIO8W組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.3 相關性分析 4組大鼠空腹血清瘦素水平與下丘腦NPY水平、NPY mRNA表達水平均呈正相關(r=0.951、0.953,P<0.05)。
2型糖尿病作為一種代謝性疾病已成為人類健康的第三大殺手,預防和治療糖尿病迫在眉睫[11]。瘦素是脂肪細胞分泌的一種調(diào)節(jié)能量平衡的重要激素,與2型糖尿病發(fā)病密切相關[12]。瘦素通過與其受體結合從而發(fā)揮中樞性和外周性生物學效應,在中樞瘦素主要通過下丘腦NPY這個中介物發(fā)揮作用[13-14]。NPY是由下丘腦弓狀核神經(jīng)元分泌和產(chǎn)生的,通過刺激進食、抑制產(chǎn)熱和提高胰島素水平來達到能量平衡[15]。大量動物研究表明,下丘腦的NPY神經(jīng)元上含有瘦素受體,腦室注射瘦素可顯著降低下丘腦NPY mRNA的表達;血清中瘦素水平減少,能使下丘腦NPY分泌增加,使大鼠出現(xiàn)多食、肥胖和血糖增高[16]。故現(xiàn)在認為瘦素與下丘腦NPY構成了瘦素-下丘腦NPY軸,參與攝食,影響糖脂代謝。目前對瘦素-下丘腦NPY軸的研究主要局限于肥胖及2型糖尿病患者,而本研究觀察了2型糖尿病發(fā)生過程中NPY的變化及其與瘦素之間的關系。
本研究顯示,在2型糖尿病大鼠模型形成過程中, DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于正常對照組,DIO8W組、2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于DIO4W組, 2型糖尿病組空腹血清瘦素水平高于DIO8W組,提示隨著動物體質(zhì)量的逐漸增加,空腹血清瘦素水平逐漸升高,機體對瘦素的反應減弱或無反應,即發(fā)生了瘦素抵抗,與張松筠等[10]的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn),DIO4W組、DIO8W組、2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達水平均高于正常對照組,DIO8W組、2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達水平均高于DIO4W組, 2型糖尿病組的下丘腦NPY水平和NPY mRNA表達水平高于DIO8W組,提示在2型糖尿病大鼠模型形成過程中,下丘腦NPY 水平及NPY mRNA表達均逐漸增強,且與血清瘦素水平呈正相關。其可能機制與瘦素抵抗有關:瘦素的下游信號(如瘦素受體)出現(xiàn)結構及功能障礙[10],使其不能正常發(fā)揮生理作用,包括對NPY神經(jīng)元的抑制,于是導致下丘腦NPY 水平上調(diào)。NPY是強效的食欲刺激因子,其表達上調(diào)可引起大鼠攝食與體質(zhì)量的明顯增加。
總之,隨著2型糖尿病大鼠模型的形成,下丘腦NPY水平及血清瘦素水平顯著升高,提示瘦素-下丘腦NPY軸功能異常,出現(xiàn)瘦素抵抗。瘦素抵抗對NPY神經(jīng)元的抑制減弱,使NPY表達水平升高,食欲增加,進一步促進肥胖,加重胰島素抵抗,導致2型糖尿病的形成。但本研究只觀察了上述一種現(xiàn)象,對其具體分子通路方面,還有待進一步研究。雖然還不清楚瘦素-下丘腦NPY軸是否為2型糖尿病的致病因素,但對其在2型糖尿病形成中的變化的研究將有助于對糖尿病發(fā)病機制的進一步認識,并為糖尿病的診斷及治療開辟新的途徑。
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