張永標(biāo)，劉小云，符永玫，畢筱剛，張扣興

基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)為MMPs家族中的成員之一，可以降解明膠、彈性蛋白、Ⅳ型和Ⅴ型膠原，在血管形成、組織再生、動(dòng)脈粥樣病變、細(xì)胞遷移、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理和生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。有研究表明，MMP-9基因啟動(dòng)子-1562C/T位點(diǎn)的多態(tài)性與一些呼吸系統(tǒng)疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺結(jié)核有關(guān)[2-3]，而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MMP-9及其基因-1562C/T多態(tài)性與社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pnenmonia，CAP)的關(guān)系則少有報(bào)道。本研究對(duì)廣東漢族人群社區(qū)CAP患者血清MMP-9的水平、MMP-9基因-1562C/T的基因型與等位基因進(jìn)行了檢測(cè)，并以健康廣東漢族人群為對(duì)照，旨在揭示MMP-9是否參與了CAP的病理過(guò)程，以及MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性對(duì)廣東漢族人群CAP的遺傳易患性及對(duì)MMP-9的表達(dá)水平是否存在影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例組 納入2012年5—12月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門急診和住院診治的廣東漢族CAP患者100例為病例組，其中男44例，女56例；年齡23～61歲，平均(37.4±2.1)歲?；颊叻?006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)新近出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，并出現(xiàn)膿性痰，伴或不伴胸痛；(2)發(fā)熱；(3)肺實(shí)變體征和/或聞及濕性啰音；(4)白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴細(xì)胞核左移；(5)胸部X線檢查顯示片狀、斑片狀浸潤(rùn)性陰影或間質(zhì)性改變，伴或不伴胸腔積液。以上(1)～(4)項(xiàng)中任何一項(xiàng)加第(5)項(xiàng)，并排除肺結(jié)核、肺部腫瘤、非感染性肺間質(zhì)性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)癥及肺血管炎后，即可明確臨床診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)其他肺部基礎(chǔ)疾病如COPD、哮喘、支氣管擴(kuò)張癥、肺結(jié)核等；(2)心腦血管疾病如高血壓、冠心病、心力衰竭、腦卒中及其后遺癥等；(3)自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等；(4)代謝性疾病如糖尿病等；(5)應(yīng)用激素或免疫抑制劑；(6)各種腫瘤性疾病；(7)慢性肝炎、肝硬化；(8)慢性腎功能不全?；颊呔邪l(fā)熱癥狀(最高腋下體溫≥37.3 ℃)。

1.1.2 對(duì)照組 以同期本院門診體檢的健康廣東漢族體檢者96例為對(duì)照組，其中男42例，女54例；年齡20～60歲，平均(38.1±1.5)歲。廣東漢族人群指3代以上均為漢族血緣且籍貫為廣東省，受試者之間均無(wú)血緣關(guān)系。本研究獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。病例組與對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 0.001，P=0.972；t=0.675，P=0.512)。

1.2 標(biāo)本收集與保存 采集病例組發(fā)病期(處于發(fā)熱期間)和對(duì)照組空腹外周靜脈血6 ml分別置于干燥管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管。病例組治療后(最高腋下體溫≤37.2 ℃后1周)再采集空腹外周靜脈血3 ml置于干燥管。干燥管室溫靜置30 min后，2 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm,取上清至已消毒EP管中，待測(cè)MMP-9；EDTA抗凝管中全血采用血液基因組提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit，北京天根科技有限公司)提取全血DNA作為PCR模板，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將分離后的血清和提取所得的基因組DNA均置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆茫繕?biāo)本收集完畢后統(tǒng)一檢測(cè)。

1.3 血清MMP-9水平測(cè)定 應(yīng)用人MMP-9 ELISA 試劑盒(KE1175 Human MMP-9 ELISA Kit，美國(guó)Immunoway公司)，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法檢測(cè)血清中MMP-9水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法分析病例組與對(duì)照組MMP-9基因-1562C/T位點(diǎn)的多態(tài)性。應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′，下游引物序列為5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′，并委托美國(guó)Invitrogen公司合成，產(chǎn)物長(zhǎng)度436 bp。PCR反應(yīng)體系為模板DNA 20～100 ng，10×PCR Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 mmol，Premix Ex TaqTM酶(日本TAKARA公司)0.75 U，dNTPs 200 μmol，200 nmol/L上、下游引物各1.0 μl，用ddH2O補(bǔ)足至終體積20.0 μl。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(35次循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶Sph I(日本TAKARA公司)進(jìn)行酶切，酶切體系為PCR產(chǎn)物10.0 μl，10×H Buffer 2.0 μl，Sph I內(nèi)切酶1.0 μl，ddH2O 7.0 μl，終體積20.0 μl，37 ℃水浴過(guò)夜消化。酶切后產(chǎn)物分析采用2%瓊脂糖凝膠電泳法，電泳后僅有436 bp一條條帶為CC基因型，有242 bp、194 bp兩條條帶為TT基因型，有436 bp、242 bp、194 bp三條條帶為CT基因型。

1.5 MMP-9基因-1562C/T PCR產(chǎn)物測(cè)序分析 隨機(jī)抽取酶切后產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示為CC、CT、TT基因型的酶切前PCR產(chǎn)物各5份，送美國(guó)Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證酶切后產(chǎn)物電泳結(jié)果。測(cè)序獲得的核苷酸序列在-1562位堿基處僅有C單峰為CC基因型，僅有T單峰為TT基因型，有CT雙峰為CT基因型。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組血清MMP-9水平比較 病例組發(fā)病期、治療后和對(duì)照組的血清MMP-9水平分別為(342.85±107.63)、(203.57±80.61)、(184.74±93.46)μg/L。病例組發(fā)病期MMP-9水平高于治療后和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t配對(duì)=4.512，t=5.305，P<0.05)；病例組治療后MMP-9水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.429，P=0.143)。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序與酶切后電泳結(jié)果 酶切后產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，病例組CC基因型73例、CT基因型27例；對(duì)照組CC基因型71例、CT基因型25例；兩組均未檢測(cè)到TT基因型。部分酶切后產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖1。隨機(jī)抽取的酶切前PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與酶切后產(chǎn)物電泳結(jié)果所示基因型完全一致。

注：M為DNA Marker DL2000，1、2、3、5、6、8泳道為CC基因型，4、7泳道為CT基因型

圖1 PCR產(chǎn)物酶切后凝膠電泳圖

Figure1 Electrophoregram of enzymolysis PCR produce

2.3 Hardy-Weinberg平衡分析結(jié)果 病例組與對(duì)照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律(P>0.05，見(jiàn)表1)。

表1 病例組與對(duì)照組-1562C/T基因型的Hardy-Weinberg平衡分析 (例)

Table1 Hardy-Weinberg balance analysis of genotypes of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

2.4 -1562C/T基因型及等位基因頻率分布 兩組CC基因型、CT基因型的頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C等位基因和T等位基因的頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

表2 病例組與對(duì)照組-1562C/T基因型頻率及等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of genotypes and alleles distribution of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

組別例數(shù) 基因型CC CT TT等位基因C T對(duì)照組9671(74 0)25(26 0)0167(87 0)25(13 0)病例組10073(73 0)27(27 0)0173(86 5)27(13 5)χ2值0 0230 020P值0 8790 889

2.5 -1562C/T基因型對(duì)血清MMP-9水平的影響 病例組CC基因型與CT基因型患者發(fā)病期血清MMP-9水平，對(duì)照組CC基因型與CT基因型者血清MMP-9水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

Table3 Comparison of the serum MMP-9 level between different genotypes of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

組別例數(shù)MMP-9CC CTt值P值對(duì)照組96175 23±89 46169 36±93 340 9760 160病例組100314 13±125 13320 29±118 121 2900 100

注：MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9

3 討論

MMP-9基因定位于人類染色體20q11.1-13.1上，其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受上游啟動(dòng)子的調(diào)控，多種炎性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子通過(guò)與啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或抑制元件結(jié)合后，可啟動(dòng)或關(guān)閉MMP-9基因的表達(dá)[1]。因此，MMP-9基因啟動(dòng)子上一些位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性和機(jī)體內(nèi)MMP-9的水平與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著密切關(guān)系。

有研究表明MMP-9參與了肝纖維化、急性冠脈綜合征、急性腦梗死等疾病的發(fā)病過(guò)程[5-7]。本研究結(jié)果顯示，CAP患者發(fā)病期血清MMP-9水平較對(duì)照組明顯升高，而在治療后又明顯下降，且降至與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的水平，提示MMP-9參與了CAP的炎性反應(yīng)過(guò)程。此外有研究結(jié)果認(rèn)為，循環(huán)中MMP-9的水平以及MMP-9與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)的比值(MMP-9/TIMP-1)尚可作為判斷CAP病情嚴(yán)重性的指標(biāo)[8]。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，在肺炎支原體引起的成人CAP患者中，外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)MMP-9的表達(dá)和血清MMP-9的水平在急性期顯著高于恢復(fù)期，且血清MMP-9的水平與外周血白細(xì)胞有關(guān)，說(shuō)明CAP時(shí)MMP-9水平升高的主要原因之一是由于白細(xì)胞高水平表達(dá)MMP-9[9]。MMP-9可降解胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，有利于促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞向炎癥部位遷移。至于MMP-9在CAP中的誘導(dǎo)產(chǎn)生和作用機(jī)制等尚待于進(jìn)一步研究。

本研究中病例組與對(duì)照組MMP-9基因啟動(dòng)子-1562C/T位點(diǎn)的CC、CT、TT基因型及C、T等位基因分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同基因型的患者之間和對(duì)照組血清MMP-9的水平亦均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果揭示了廣東漢族人群MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性與CAP的遺傳易患性無(wú)關(guān)，且不影響MMP-9的表達(dá)水平。本研究結(jié)果與Chiang等[10]報(bào)道的MMP-9基因多態(tài)性與CAP關(guān)系的研究結(jié)果相同。有關(guān)-1562C/T多態(tài)性對(duì)MMP-9表達(dá)水平影響的研究結(jié)果并不一致。國(guó)外Demacq等[ 11 ]研究發(fā)現(xiàn)，巴西健康白人MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性對(duì)MMP-9的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。Ghaderian等[12]報(bào)道急性心肌梗死患者-1562C/T位點(diǎn)TT和CT基因型的血清MMP-9水平明顯高于CC基因型。MMP-9表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制目前尚不明確，因而無(wú)法對(duì)這些研究結(jié)果給予合理解釋。本研究中CAP患者的血清MMP-9水平明顯升高，-1562C/T多態(tài)性不影響CAP患者和對(duì)照組MMP-9的表達(dá)水平，提示CAP時(shí)MMP-9的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)可能受到MMP-9基因啟動(dòng)子上其他多態(tài)性位點(diǎn)的調(diào)控，或存在其他影響MMP-9分泌、活化的調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，MMP-9參與了CAP的炎性反應(yīng)過(guò)程，MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性與廣東漢族人群CAP的易患性無(wú)關(guān)，且不影響MMP-9的表達(dá)水平。本研究對(duì)象為廣東漢族人群，Chiang等[10]的研究對(duì)象為未分種族的臺(tái)灣地區(qū)人群。本研究中病例組與對(duì)照組的基因型分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡分析表明樣本具有群體代表性，由于不同區(qū)域和種族的人群中MMP-9基因的多態(tài)性可能不完全相同，因此本研究的局限性在于其結(jié)果僅可反映廣東漢族人群，尚不代表中國(guó)其他種族人群或其他區(qū)域漢族人群。對(duì)于廣東漢族人群MMP-9基因啟動(dòng)子中非-1562C/T位點(diǎn)、中國(guó)其他種族人群或其他區(qū)域漢族人群MMP-9基因啟動(dòng)子中包括-1562C/T位點(diǎn)的多態(tài)性與CAP遺傳易患性的關(guān)系及其對(duì)MMP-9表達(dá)水平的影響等均值得更進(jìn)一步研究。

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