張 珊，郭俊霞，張艷貞，張 靜，陳 文

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191）

牛磺酸對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇水平的影響

張 珊，郭俊霞，張艷貞，張 靜，陳 文*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191）

目的：探討?；撬釋?duì)人肝癌細(xì)胞HepG2總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）、膽固醇酯（cholesterol ester，EC）水平及對(duì)膽固醇代謝限速酶——膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）蛋白表達(dá)的影響。方法：在培養(yǎng)液中添加終濃度為0.1、1、10、20 mmol/L的?；撬幔謩e在培養(yǎng)24、48 h后測定細(xì)胞內(nèi)TC、FC及EC水平；在培養(yǎng)液中添加終濃度為20 mmol/L的?；撬?，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后檢測CYP7A1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：1、10、20 mmol/L的?；撬峋墒笻epG2細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平明顯下降，且與?；撬釢舛瘸收?，但EC水平在?；撬釢舛冗_(dá)1 mmol/L后即不隨?；撬釢舛鹊脑黾佣M(jìn)一步降低；培養(yǎng)48 h后HepG2細(xì)胞TC、FC水平的降低幅度大于24 h時(shí)；20 mmol/L牛磺酸使FC含量減少的作用強(qiáng)于對(duì)EC減少的作用；培養(yǎng)24 h后HepG2細(xì)胞中CYP7A1蛋白表達(dá)最強(qiáng)。結(jié)論：?；撬峥稍鰪?qiáng)CYP7A1蛋白表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞內(nèi)的膽固醇代謝，膽固醇降低程度與?；撬釢舛燃白饔脮r(shí)間相關(guān)，作用48 h的效果明顯優(yōu)于24 h，且?；撬嶂饕墙档土思?xì)胞內(nèi)的FC水平。

?；撬幔荒懝檀?；膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）；HepG2細(xì)胞

牛磺酸富含于海產(chǎn)品中，是一種結(jié)構(gòu)簡單的小分子含硫氨基酸。它主要以游離形式存在于哺乳動(dòng)物的心臟、肝臟、視網(wǎng)膜等組織器官中，是蛋氨酸、半胱氨酸的代謝產(chǎn)物[1]。多年來，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明?；撬峥梢燥@著降低飲食性高脂血癥大鼠、小鼠、豚鼠血清和肝臟的總膽固醇含量[2-6]，臨床實(shí)驗(yàn)也顯示牛磺酸能有效降低志愿者的血清總膽固醇含量與動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，從而降低心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。

雖然?；撬峤的懝檀嫉捏w外研究報(bào)道不多，但有研究[9-11]顯示?；撬崮軌蛟黾尤烁伟┘?xì)胞HepG2和鼠肝癌細(xì)胞H4IIE的膽固醇降解限速酶——膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）mRNA水平，并降低HepG2細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，探討?；撬釋?duì)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）、游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）、膽固醇酯（cholesterol ester，EC）水平及CYP7A1蛋白表達(dá)的影響，以期為?；撬峤的懝檀甲饔眉捌浞肿訖C(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胎牛血清美國Gibco公司；膽固醇（純度≥99%）、?；撬幔兌龋?9%）、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶、膽固醇酯水解酶、水合牛膽酸鈉、苯酚、4-氨基安替比林 美國Sigma公司；CYP7A1一抗（兔抗人H-58：sc-25536）、CYP7A1二抗（山羊抗兔IgG-HRP：sc-2004） 美國Santa Cruz公司；β-actin一抗（兔抗人） 美國GenView公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

uQuant Bio-Tek酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國通用公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)10%）的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，以1×105～2×105個(gè)/孔接種于6 孔板中。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)牛磺酸終濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率約為88%，終濃度達(dá)到30 mmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率不到70%，故本實(shí)驗(yàn)中將牛磺酸的最大濃度設(shè)為20 mmol/L，即分別在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1、1、10、20 mmol/L的?；撬幔⑼瑫r(shí)設(shè)置對(duì)照組，孵育24 h或48 h。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平測定[12-13]

用磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞2 次，每孔細(xì)胞加入1 mL正己烷-異丙醇（2∶1，V/V），室溫下慢搖，以提取細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，通氮?dú)?0 min除去有機(jī)溶劑，以含TritonX-100（體積分?jǐn)?shù)10%）的異丙醇130 μL振蕩溶解上述脂類提取物。

按照表1配制TC、FC測定工作液。取50 μL脂類提取物，分別加入TC和FC測定工作液，37 ℃水浴30 min，用酶標(biāo)儀于500 nm波長處測定吸光度。

表1 膽固醇測定工作液配制成分Table1 Preparation of working solutions for cholesterol detection

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量測定

細(xì)胞完成脂類物質(zhì)提取后，加入裂解液冰上提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。取上清液即為測試樣品，并以BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。

膽固醇含量以膽固醇與蛋白質(zhì)的比值（μg/mg pro）表示；膽固醇酯（EC）=TC－FC。

1.3.4 Western blotting法測定CYP7A1蛋白表達(dá)

用裂解液裂解細(xì)胞并收集蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉1 h，分別與CYP7A1抗體和內(nèi)參β-actin抗體4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液漂洗3 次后加入二抗，室溫孵育2 h。以ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑曝光成像并經(jīng)ECL凝膠成像系統(tǒng)掃描。系統(tǒng)分析結(jié)果，分別計(jì)算各組CYP7A1與β-actin的灰度比值，代表每組CYP7A1的蛋白表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬釋?duì)細(xì)胞膽固醇水平的影響

表2 不同濃度?；撬嶙饔?4 h對(duì)HepG2細(xì)胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table2 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 24 h culture (±s, n=6)

表2 不同濃度牛磺酸作用24 h對(duì)HepG2細(xì)胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table2 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 24 h culture (±s, n=6)

注：*. 與對(duì)照組相比顯著差異（P＜0.05）。下同。

μg/mg pro組別對(duì)照組牛磺酸添加量/（mmol/L）0.111020 TC含量232.1±11.9 231.8±11.9 216.7±9.7*207.4±8.2*195.9±9.1*FC含量161.9±10.8 162.2±10.4 152.6±9.2 143.9±8.1*133.7±9.6*EC含量70.2±4.869.6±3.364.0±5.9*63.6±3.5*62.1±3.5*

由表2可知，培養(yǎng)24 h后，0.1 mmol/L?；撬釋?duì)HepG2細(xì)胞的TC、FC及EC水平無影響。當(dāng)?；撬釢舛葹?、10、20 mmol/L時(shí)，細(xì)胞TC水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），下降幅度分別為6.7%、10.7%、15.6%，EC水平也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），分別降低了8.8%、9.4%、11.5%。FC水平則下降了6.0%、11.2%（P＜0.05）、17.4%（P＜0.05）。由以上結(jié)果可知，細(xì)胞TC、FC水平的降低與?；撬釢舛瘸室蕾囮P(guān)系，以?；撬釢舛葹?0 mmol/L時(shí)膽固醇水平下降最多，EC水平則在牛磺酸達(dá)到1 mmol/L后不再隨?；撬釢舛鹊脑黾佣M(jìn)一步降低。

表3 不同濃度牛磺酸作用48 h對(duì)HepG2細(xì)胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table3 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 48 h culture (±s, n=6)

表3 不同濃度?；撬嶙饔?8 h對(duì)HepG2細(xì)胞TC、FC及EC水平的影響（±s，n＝6）Table3 Effect of taurine concentration on intracellular TC, FC and EC levels after 48 h culture (±s, n=6)

μg/mg pro組別對(duì)照組?；撬崽砑恿?（mmol/L）0.111020 TC含量236.6±4.2 227.3±4.5*204.2±5.6*184.0±5.7*172.4±7.0*FC含量170.7±7.4 163.4±4.6 151.3±8.9*131.3±5.6*111.6±6.9*EC含量65.9±6.864.0±5.152.9±7.9*52.7±9.9*60.8±7.9

由表3可知，添加不同濃度的牛磺酸作用48 h后，HepG2細(xì)胞TC、FC、EC水平均有不同程度的降低。牛磺酸濃度為0.1 mmol/L時(shí)，細(xì)胞TC水平減少了3.9%（P＜0.05）。當(dāng)?；撬釢舛葹?、10、20 mmol/L時(shí)，細(xì)胞TC水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），下降幅度分別為13.7%、22.2%、27.1%，F(xiàn)C水平也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），下降幅度分別為11.39%、23.11%、34.62%，EC水平則分別減少了20.0%（P＜0.05）、20.0%（P＜0.05）、8.0%。由以上結(jié)果可以看出，細(xì)胞TC、FC水平的降低與?；撬釢舛瘸收龋耘；撬釢舛葹?0 mmol/L時(shí)膽固醇水平下降最多，但EC水平則在?；撬徇_(dá)到1 mmol/L后不再隨?；撬釢舛鹊脑黾佣M(jìn)一步降低。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞CYP7A1蛋白表達(dá)的影響

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CYP7A1蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Table4 Effect of culture time on the protein expression of CYP7A1±s, n=3)

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CYP7A1蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Table4 Effect of culture time on the protein expression of CYP7A1±s, n=3)

注：#. 與12、48、72 h組相比差異顯著（P＜0.05）。下同。

組別對(duì)照組20 mmol/L?；撬?2 h24 h48 h72 h灰度比值0.41±0.070.74±0.05*1.58±0.02*#1.01±0.05*0.68±0.10*

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CYP7A1蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of culture time on the protein expression of CYP7A1

由2.1節(jié)結(jié)果可知，培養(yǎng)24、48 h，都是20 mmol/L外源性?；撬峥勺畲蟪潭冉档图?xì)胞中膽固醇的水平。因此選擇20 mmol/L?；撬崽接懫鋵?duì)CYP7A1蛋白表達(dá)的影響。由表4、圖1可知，添加20 mmol/L?；撬岱謩e作用12、24、48、72 h，CYP7A1的蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），其中以作用24 h時(shí)效果最為明顯。

3 討 論

機(jī)體維持膽固醇平衡的3 條途徑分別是合成、降解、排出體外。膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）是膽固醇降解限速酶，是膽固醇降解為膽汁酸的關(guān)鍵酶，在膽固醇的代謝過程中起重要作用。

降低血清膽固醇是牛磺酸的重要生理功能之一。Yokogoshi等[14]研究結(jié)果顯示，飼料中添加5%的?；撬峥墒垢咧攀痴T導(dǎo)的高膽固醇血癥大鼠肝臟CYP7A1 mRNA水平增加95%，并顯著降低血清TC水平。Murakami等[15]研究證實(shí)，對(duì)于高脂膳食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥小鼠，長期給予?；撬峥梢源龠M(jìn)膽固醇的降解，?；撬犸@著提高了小鼠膽汁中?；悄懰岬谋壤黾恿思S便中膽汁酸的排出。到目前為止，多個(gè)研究小組已通過大鼠、小鼠、豚鼠等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明?；撬峥梢杂行Ы档脱搴透闻K中的膽固醇含量，提高肝臟CYP7A1的活性，并促進(jìn)糞便中膽汁酸的排出，從而起到降低膽固醇和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6,16-17]。

關(guān)于?；撬釋?duì)膽固醇代謝的影響大多是在整體動(dòng)物水平上進(jìn)行研究的，體外研究報(bào)道不多。HepG2細(xì)胞保留了正常人體肝細(xì)胞的多種生理特性[18-20]，因此?；撬峤的懝檀甲饔玫捏w外研究多以HepG2細(xì)胞為模型。Yanagita等[10]研究指出，在DMEM培養(yǎng)基中添加10－3mol/L?；撬?，培養(yǎng)24 h后HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平下降約19%，膽固醇酯的合成受到抑制。Lam等[9]研究表明，無論細(xì)胞是否在高膽固醇條件下培養(yǎng)，?；撬岫紩?huì)顯著提高HepG2細(xì)胞CYP7A1 mRNA水平，促進(jìn)膽固醇的降解。而Hoang等[11]曾用大鼠肝癌細(xì)胞H4IIE探討了?；撬釋?duì)膽固醇代謝的影響，結(jié)果顯示在MEM培養(yǎng)基中添加10－4mol/L?；撬?，H4IIE細(xì)胞的CYP7A1 mRNA水平增加了3 倍之多，也表明牛磺酸通過提高CYP7A1表達(dá)而促進(jìn)膽固醇降解。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇以游離和酯化兩種形式存在，但是到目前為止，未見有在細(xì)胞水平系統(tǒng)研究牛磺酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)TC、FC、EC水平及CYP7A1表達(dá)影響的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為對(duì)象，探討了?；撬釋?duì)細(xì)胞內(nèi)TC、FC、EC水平及CYP7A1蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)的TC由2/3的FC和1/3的EC組成，1、10、20 mmol/L的牛磺酸均可使HepG2細(xì)胞TC、FC水平明顯下降，且與?；撬釢舛瘸收龋粡呐囵B(yǎng)時(shí)間上看，添加?；撬釋?duì)細(xì)胞培養(yǎng)48 h，TC、FC的降低幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培養(yǎng)24 h，表明培養(yǎng)48 h作用時(shí)間充分，?；撬岬慕的懝檀夹Ч?；但無論培養(yǎng)24 h還是48 h，細(xì)胞EC水平則在?；撬徇_(dá)到1 mmol/L后就不再隨?；撬釢舛鹊脑黾佣M(jìn)一步降低；當(dāng)?；撬釢舛葹?0 mmol/L時(shí)，無論培養(yǎng)24 h還是48 h，細(xì)胞FC水平的降低都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于EC，表明牛磺酸降膽固醇作用主要是通過降低細(xì)胞內(nèi)FC水平而實(shí)現(xiàn)的。以上結(jié)果提示，?；撬峥梢源龠M(jìn)HepG2細(xì)胞膽固醇水平下降，且降低程度與外源性?；撬釢舛燃白饔脮r(shí)間相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，膽固醇水平的降低程度與?；撬釢舛瘸收?，作用48 h的效果明顯優(yōu)于24 h，且?；撬峤的懝檀甲饔弥饕墙档土思?xì)胞內(nèi)FC的水平。

依據(jù)20 mmol/L外源性?；撬峥勺畲蟪潭冉档图?xì)胞中膽固醇水平的結(jié)果，選定20 mmol/L牛磺酸，采用Western blotting方法測定了其對(duì)CYP7A1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，添加20 mmol/L?；撬崤囵B(yǎng)24 h時(shí)，細(xì)胞CYP7A1的表達(dá)最強(qiáng)，這與Lam等[9]的研究結(jié)果基本一致。結(jié)合以上結(jié)果，牛磺酸作用48 h的降膽固醇作用要明顯強(qiáng)于作用24 h，這可能是由于CYP7A1蛋白在合成后需經(jīng)過后加工成為成熟的蛋白質(zhì)以及其充分發(fā)揮降膽固醇作用都需要一定的時(shí)間才能完成所致。因此，雖然牛磺酸作用24 h使細(xì)胞內(nèi)CYP7A1蛋白表達(dá)最強(qiáng)，但其降膽固醇作用在48 h時(shí)才能更好顯現(xiàn)。

綜上所述，牛磺酸可以增強(qiáng)HepG2細(xì)胞中CYP7A1蛋白的表達(dá)，20 mmol/L?；撬嶙饔?4 h時(shí)其表達(dá)最強(qiáng)；CYP7A1的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝，膽固醇降低程度與牛磺酸濃度及作用時(shí)間相關(guān)，作用48 h的效果明顯優(yōu)于24 h，且?；撬峤的懝檀甲饔弥饕w現(xiàn)為降低了細(xì)胞內(nèi)FC的水平。

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Effect of Taurine on Cholesterol Level of HepG2 Cells

ZHANG Shan, GUO Jun-xia, ZHANG Yan-zhen, ZHANG Jing, CHEN Wen*
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To study the effect of taurine on total cholesterol (TC), free cholesterol (FC) and cholesterol ester (EC) levels as well as the protein expression of the rate-limiting enzyme CYP7A1 involved in cholesterol metabolism in HepG2 cells. Methods: The levels of intracellular TC, FC and EC were determined after the cells were cultured for 24 and 48 h in DMEM supplemented with taurine at final concentrations of 0.1, 1, 10 and 20 mmol/L, respectively. The protein expression of CYP7A1 was detected after the cells were cultured for 12, 24, 48 and 72 h in DMEM with 20 mmol/L taurine. Results: The levels of intracellular TC and FC declined obviously after culture in the presence of 1,10 and 20 mmol/L taurine, suggesting a positive dose-effect relationship, but EC levels did not continue to decrease when the taurine concentration exceeded 1 mmol/L. A more pronounced decrease in intracellular TC and FC was observed when the culture time was prolonged from 24 to 48 h. Intracellular FC was reduced to a greater extent by 20 mmol/L taurine than intracellular EC. The highest protein expression of CYP7A1 was noted after 24 h culture. Conclusion: Taurine can enhance CYP7A1 expression and promote intracellular cholesterol metabolism, and the decrease of cholesterol is associated with taurine concentration and action duration, showing a superior effect at 48 h than at 24 h, and its main benefit is reducing intracellular FC.

taurine; cholesterol; cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1); HepG2 cells

TS201.4

A

1002-6630（2014）23-0284-04

10.7506/spkx1002-6630-201423055

2014-06-27

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（5142004）；北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（Zk70201404）

張珊（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與功能。E-mail：zhang.shan12@163.com

*通信作者：陳文（1966—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與功能。E-mail：wlchenwen@buu.edu.cn