李芬芬，黃丹菲，江樂明，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

大粒車前子多糖對脂多糖刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

李芬芬，黃丹菲，江樂明，謝明勇*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

采用脂多糖構(gòu)建RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，研究大粒車前子多糖的抗炎作用。培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7，利用脂多糖構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型，中性紅吞噬實驗檢測細(xì)胞吞噬活性；酶聯(lián)免疫吸附法檢測車前子精制多糖（Plantago asiat ica L. crude polysaccharide，PLCP）處理前后細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和IL-6的分泌量，Griess反應(yīng)測定RAW264.7細(xì)胞釋放NO水平。結(jié)果表明，PLCP可顯著抑制RAW264.7炎癥細(xì)胞的吞噬活性，降低炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌量及NO的釋放量。

大粒車前子；多糖；RAW264.7巨噬細(xì)胞；炎癥；抗炎

車前子為大粒車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟種子[1]，其種皮含有大量的黏液質(zhì)，是由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖構(gòu)成的雜多糖[2]，具有整腸通便[3]、降低血脂、調(diào)節(jié)血糖[4]、免疫調(diào)節(jié)[5-6]及抗氧化清除自由基[7]等功能，但有關(guān)其在抗炎方面的研究并不多，而其產(chǎn)生抗炎作用的分子生物學(xué)機(jī)制也還不明確。

炎癥是機(jī)體的防御性反應(yīng)，通常對機(jī)體是有利的，但過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致體內(nèi)釋放過多的炎癥性介質(zhì)，引起局部或全身的炎癥性反應(yīng)[8]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞，參與機(jī)體的大多數(shù)免疫反應(yīng)，它能清除衰老的宿主細(xì)胞和分子，在機(jī)體抵御感染的過程中也起到重要的作用[9]，是炎癥過程的關(guān)鍵角色之一，主要體現(xiàn)在炎癥部位高濃度趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化并向感染部位募集，活化的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分泌白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等趨化因子，誘導(dǎo)更多的巨噬細(xì)胞活化募集，釋放IL-6等促炎癥因子及前列腺素等炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)和加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)[10-11]。本實驗擬通過脂多糖（lipopolyssacharide，LPS）刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型，探討車前子多糖對巨噬細(xì)胞的抗炎作用，不僅為深入研究車前子抗炎活性物質(zhì)及其作用機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)，也為開發(fā)大粒車前子資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車前子產(chǎn)自江西吉安；RAW264.7細(xì)胞系購自上海細(xì)胞生物研究所。

RPMI 1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、L-谷氨酰胺、β-二巰基乙醇、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素 美國HyClone公司；Griess檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；LPS 美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒 武漢博士德公司；中性紅 溫州市化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15-高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 大粒車前子多糖的提取與純化

采用水提醇沉法從大粒車前子中提取多糖成分，優(yōu)化的提取條件為：大粒車前子粉末與水（1∶10，m/V）在100 ℃下提取3 h，重復(fù)2 次。將提取液合并濃縮，80%乙醇沉淀過夜。4 800 r/min離心10 min收集多糖沉淀，并依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇各洗滌2 次，干燥得車前子多糖，得率約為10.0%。采用Sevag法對車前子多糖進(jìn)行脫蛋白處理制備得到精制車前子多糖（Plantago asiatica L. crude polysaccharide，PLCP）[7]。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立

用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2）RAW264.7巨噬細(xì)胞并對其進(jìn)行分組?？瞻讓φ战M：不用LPS處理也不加多糖干預(yù)；模型對照組：加入10 mg/L的LPS干預(yù)；實驗組：10 mg/L的LPS干預(yù)，并用PLCP（PLCP終質(zhì)量濃度分別為20、40、80、160 μg/mL）處理。

1.3.3 細(xì)胞吞噬活性 測定

調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬細(xì)胞密度為5×105個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)3 h后洗去未貼壁細(xì)胞。每孔加入100 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，各組按相應(yīng)處理加入LPS、PLCP進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后每孔加入含中性紅（體積分?jǐn)?shù)0.1%）的生理鹽水溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，用PBS洗3 遍，每孔加入細(xì)胞溶解液（V（冰醋酸）∶V（乙醇）=1∶1）100 μL，4 ℃條件下放置2～3 h，待細(xì)胞溶解后在酶標(biāo)儀上測定540 nm波長處的光密度值。

1.3.4 NO分泌水平測定

采用Griess法對NO－2定量間接檢測NO生成。RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，各組細(xì)胞在不同處理因素作用24 h后，每孔取細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL，用Griess試劑測試，酶標(biāo)儀550 nm波長處測定吸光度。根據(jù)NaNO2制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)基中NO的生成量。

1.3.5 細(xì)胞因子分泌水平測定

取RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，不同組別按照相應(yīng)處理培養(yǎng)24 h后，取上清液進(jìn)行測定。TNF-α、IL-10和IL-6水平的測定按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PLCP對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響

圖1 PLCP對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬活性的影響Fig.1 Inhibitory effect of PLCP on the phagocytosis of LPS-stimulated RAW264.7 cells

如圖1所示，與模型對照組相比，PLCP在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（20、40 μg/mL）對LPS激活的RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性具有顯著抑制作用（P＜0.05）。

2.2 PLCP對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

表1 PLCP對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌水平的影響Table1 Inhibitory effect of PLCP on NO production in mouse macrophage cell line RAW264.7

由表1可知，和空白對照組相比，模型對照組釋放大量NO（P＜0.05），PLCP作用于LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞后，NO分泌量下降，PLCP質(zhì)量濃度為40 μg/mL時對細(xì)胞分泌NO活性的抑制效果最為顯著（P＜0.05）。

2.3 PLCP對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子的影響

表2 PLCP對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF--α、IL-6和IL--10水平的影響Table2 Inhibitory effect of PLCP on TNF-α, IL-6 and IL-10 production in LPS-stimulated RAW264.7 cellss

由表2可知，PLCP對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子有顯著影響。和模型對照組相比，在40～160 μg/mL范圍內(nèi)，PLCP能夠明顯抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6，在20～160 μg/mL范圍內(nèi)可顯著抑制LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌IL-10，且呈劑量依賴關(guān)系。

3 討 論

炎癥反應(yīng)是一種重要的機(jī)體防御過程，涉及機(jī)體活動的許多環(huán)節(jié)，其中免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）的激活是炎癥反應(yīng)的啟動環(huán)節(jié)[13]。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，RAW264.7細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞的一種，可激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，當(dāng)機(jī)體受LPS等外界因素刺激后，能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，發(fā)揮免疫功能[14]。許多研究發(fā)現(xiàn)多糖能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，并揭示了多糖與其表面受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的作用機(jī)理[15]。因此本實驗以LPS刺激RAW264.7細(xì)胞為模型，探討PLCP對巨噬細(xì)胞的抗炎作用。

巨噬細(xì)胞是一種主要的專職吞噬細(xì)胞，是機(jī)體的清道夫，可以通過其表面受體識別并吞噬入侵機(jī)體的病原菌及本身衰老和死亡的細(xì)胞，從而提高機(jī)體機(jī)能[16]。中性紅吞噬實驗顯示，低質(zhì)量濃度的PLCP能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性，說明PLCP可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并且低質(zhì)量濃度的PLCP能有效地防止巨噬細(xì)胞的過度活化。

LPS刺激后的巨噬細(xì)胞可大量表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）并分泌大量的NO。NO作為體內(nèi)重要的信使和效應(yīng)分子，對細(xì)菌等病原體具有殺傷和細(xì)胞毒性作用[17]，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。但NO的過量釋放會損傷正常的細(xì)胞，引起過度炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)NO對細(xì)菌感染、創(chuàng)傷等均具有很好的療效[18]。巨噬細(xì)胞NO的合成、分泌與細(xì)胞因子有著相互調(diào)節(jié)作用[19]。當(dāng)PLCP質(zhì)量濃度在40～160 μg/mL時，能下調(diào)RAW264.7細(xì)胞釋放NO，這可能與抑制巨噬細(xì)胞的活化、減少與iNOS表達(dá)相關(guān)炎癥因子的釋放有關(guān)。

免疫細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞因子參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，而植物多糖對細(xì)胞因子以及受體表達(dá)的影響是其發(fā)揮抗炎作用的重要分子機(jī)制。TNF-α是巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的主要促炎細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長分化、增殖，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，以正反饋調(diào)控的形式參與許多炎癥反應(yīng)，具有重要的生物功能[20]。因此，本實驗測定了PLCP對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLCP在40～ 160 μg/mL范圍內(nèi)可顯著抑制RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α，且具有一定的劑量依賴性。由此可以說明PLCP可能通過下調(diào)TNF-α的表達(dá)參與抗炎反應(yīng)。IL-10是一種可由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多功能抗炎細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的功能[21-22]，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)在實驗劑量范圍內(nèi)PLCP均可顯著抑制IL-10的釋放，并符合劑量依賴關(guān)系。IL-6在先天性免疫和獲得性免疫中都具有突出的貢獻(xiàn)[24]，可調(diào)控T淋巴細(xì)胞的分化和激活，誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞的活化，維持調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞間的平衡，在慢性炎癥中發(fā) 揮了重要作用[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)在40～160 μg/mL范圍內(nèi)PLCP可顯著下調(diào)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6。以上結(jié)果表明，PLCP的抗炎作用可能與抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，保持TNF-α、IL-10和IL-6之間的平衡有關(guān)。

綜上所述，PLCP可通過抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞的吞噬作用、NO的釋放及細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮其抗炎作用，其具體的抗炎作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Immunoregulatory Effect of Polysaccharide from the Seeds of Plant ago asiatica L. on RAW264.7 Cells Stimulated with Lipopolysaccharide

LI Fen-fen, HUANG Dan-fei, JIANG Le-ming, XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

To study the immunoregulatory effect of polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L. on RAW264.7 cells, a model of inf ammation stimulated with lipopolysaccharide (LPS) was established. The phagocytic activity of the cells was observed by neutral red phagocy tosis experiments. At the same time, the levels of TNF-α, IL-10 and IL-6 in the cultural supernatant were quantif ed before and after addition of crude polysaccharide from Plantago asiatica L. (PLCP) by ELISA. In addition, the expression of NO which was suppressed by the polysaccharide was studied. The results showed that the polysaccharide could suppress cytokine levels, NO expression and phagocytic activity.

Plantago asiatica L.; polysacchar ide; RAW264.7 cells; inf ammation; anti-inf ammation

TS201.2

A

1002-6630（2014）23-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201423048

2014-06-26

國家自然科學(xué)基金重點項目（31130041）；南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室青年骨干研究基金項目（SKLF-QN-201107）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31260364）；江西省教育廳青年科學(xué)基金項目（GJJ11050）

李芬芬（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：ncusklifenfen@163.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)、食品營養(yǎng)與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn