劉佳榮，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

黃漿水中高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及鑒定

劉佳榮，梁金鐘*

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

經(jīng)初篩、復篩，從黃漿水中篩得一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的菌株，對其進行形態(tài)學及生理生化鑒定，并與GenBank上已提交的16S rDNA進行BLAST比對，結果表明，其歸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。由MEGA 6.0軟件構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，該菌株與Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性達99%，且與生理生化實驗結果一致，因此，確定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），編號為LP-Dfa301，測得其發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量為5.833 g/L。

γ-氨基丁酸；乳酸菌；黃漿水；16S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育樹

γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA），又稱氨酪酸、4-氨基丁酸，分子式為C4H9O2N，相對分子質(zhì)量為103.12[1]。結構式及三維結構見圖1。

圖1 GABA的結構式（a）及三維結構（b）Fig.1 Formula (a) and three-dimensional structure (b) of GABA

GABA有多種生理功能，如：延緩大腦衰老、降低血壓[2]、降低血氨、治療神經(jīng)疾病[3]、抗心律失常、健肝利腎、預防肥胖、醒酒、改善更年期綜合征等[4]。已成為一種新型活性因子，廣泛用于醫(yī)藥與食品領域并成為研究熱點[5]。新型GABA抑制劑研究開發(fā)的成功，以及其分子生物學方面的研究成果使GABA這一靶標引起農(nóng)藥學家和昆蟲毒理學家的重視[6]。而作為飼料添加劑可以顯著提高畜禽的生產(chǎn)能力。因此，加強GABA相關產(chǎn)品的安全性能及其副產(chǎn)品的研制開發(fā)，將豐富飼料添加劑的種類，有益于畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[7]。

目前，制備GABA的方法主要有[8]：化學合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法3 種?；瘜W法速度快、得率高，但成本高、安全性差；植物富集法含量很低，造價高且浪費資源；與前兩者比較，生物法則具有成本低、發(fā)酵周期短、產(chǎn)率較高、安全性高等優(yōu)點。微生物發(fā)酵法原以大腸桿菌作為合成GABA的菌株，但其存在安全衛(wèi)生方面的隱患[9]。利用大腸桿菌合成GABA是因為其擁有谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）活性[10]。最新的一些研究報道[11-12]稱，天然乳酸菌的耐酸生長機制可能與它們含有的GAD活力有關，啟示可以利用乳酸菌生物合成GABA。其微生物發(fā)酵原理[13-14]見圖2。

圖2 微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA原理Fig.2 Microbial fermentation for GABA production

GAD是生物體催化谷氨酸（Glu）脫羧生成GABA的關鍵酶。乳酸菌中的乳球菌和乳桿菌均具有GAD[15]。目前，已有從酒糟中分離出短乳桿菌（Lactobacillus brevis）[16]、從酸菜中分離出嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）[17]和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[18]等的報道。

國內(nèi)許多學者都對產(chǎn)GABA的乳酸菌有所研究及篩選，東北農(nóng)業(yè)大學的姚子鵬等[19]對乳酸菌發(fā)酵黃漿水富集GABA有所研究，但未從黃漿水中篩選產(chǎn)GABA的菌株。隨著我國豆腐行業(yè)的發(fā)展，黃漿水的產(chǎn)量越來越高，因此，黃漿水的處理問題日益受到關注。黃漿水中富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和無機鹽[20]，適應微生物生長。從中篩選出產(chǎn)GABA的菌株，可以增加黃漿水的利用價值。而且國內(nèi)生物法生產(chǎn)GABA大部分進行全細胞轉(zhuǎn)化液固定化生產(chǎn)，產(chǎn)率雖高，但其運用的磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）等輔酶造價卻很高，且固定化步驟繁瑣不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本實驗旨在從黃漿水中篩選出一株高產(chǎn)GABA的菌株并對其進行生理生化鑒定及構建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)GABA，為今后大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)GABA的實現(xiàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水，取自農(nóng)貿(mào)市場。

硅膠板（GF254） 浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；γ-氨基丁酸 上海阿拉丁公司；冰乙酸 沈陽市新西試劑廠；L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG） 黑龍江成褔食品有限公司；溶菌酶 北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Binding Buffer 科博賽爾科技發(fā)展有限公司；正丁醇 天津市永大化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Motic BA200顯微鏡 上海儀圓光學儀器廠；S-3400掃描電鏡 天美日立公司；BS 224S電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LRH-生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；723N可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；H1650-W臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；T100-PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司；SIM凝膠透成像系統(tǒng) 百維信生物生物科技有限公司；JY5000電泳儀 北京市君意機電技術公司。

1.3 培養(yǎng)基

乳酸菌分離培養(yǎng)基（BCP培養(yǎng)基）[18]：乳糖5.0 g/L、酵母粉5.0 g/L，溴甲酚紫溶液（質(zhì)量濃度5 g/100 mL水溶液）2.5 mL，pH 6.8～7.0。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20.0 g/L（121 ℃，滅菌15 min）。

菌種活化、保藏及分離培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、牛肉粉10.0 g/L、無水乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO40.25 g/L、K2HPO42.0 g/L，吐溫-80 1.0 mL，自然pH值。固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20.0 g/L（121 ℃，滅菌15 min）。

發(fā)酵培養(yǎng)基（TYG培養(yǎng)基）：胰蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、丁二酸鈉5.0 g/L、L-MSG 10.0 g/L，自然pH值（105 ℃，滅菌20 min）。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離篩選

將購自農(nóng)貿(mào)市場的黃漿水充分搖勻后按2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)48 h，取1 mL菌液加入9 mL無菌生理鹽水制成菌懸液，進行梯度稀釋。取0.1 mL適宜稀釋倍數(shù)的菌懸液涂布于固體BCP平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單個周圍發(fā)黃菌落于固體MRS平板上，反復3～4 次劃線，至菌落性狀穩(wěn)定后轉(zhuǎn)接到MRS試管斜面中保存[21]。

1.4.2 GABA的測定

1.4.2.1 GABA的定性測定

將斜面中的菌株接種到MRS中，37 ℃培養(yǎng)20 h，再按2%的接種量接種于TYG培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h。7 000 r/min離心10 min，取上清液點樣，采用改良薄層層析法進行定性分析[22]。薄層層析展開劑為：V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3（含4 g/L水合茚三酮），以1 g/L GABA做對照，距離硅膠板底邊緣1 cm點樣2 μL（直徑不超過4 mm），展開劑中層析2 h，層析完畢自然干燥后90 ℃顯色10 min，比較Rf值。

1.4.2.2 GABA的定量測定

Berthelot改良比色法[23]標準曲線的繪制：配制質(zhì)量濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 g/L的GABA標準溶液。取0.4 mL不同質(zhì)量濃度的GABA標準溶液，分別加入1 mol/L的Na2CO3溶液0.1 mL；0.2 mol/L pH 9.0的四硼酸鈉緩沖溶液0.5 mL；質(zhì)量濃度為6 g/100 mL的苯酚水溶液1 mL；含有10%有效氯的次氯酸鈉溶液1 mL，振蕩混勻，放置10 min。然后沸水浴10 min；最后冰浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍綠色后加入體積分數(shù)為60%乙醇水溶液2 mL，振蕩混勻，放置30 min。在640 nm波長處測定其光密度值，并做平行樣。最后以GABA的質(zhì)量濃度為橫坐標，OD640nm為縱坐標繪制標準曲線。

將復篩后的菌株進行發(fā)酵實驗，將液體MRS培養(yǎng)基的種子液按2%的接種量接種于TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h，7 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，稀釋10～20 倍，取0.4 mL稀釋后的發(fā)酵液，根據(jù)1.4.2.2節(jié)中測定GABA標準曲線的方法測定GABA含量。同時取適量發(fā)酵液，送至農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）進行氨基酸分析及GABA產(chǎn)量測定。對比Berthelot比色法確定GABA產(chǎn)量。

1.4.3 菌株的鑒定

1.4.3.1 菌株的形態(tài)學及生理生化鑒定

挑取單個菌落進行革蘭氏染色，觀察其形態(tài)并做電鏡掃描。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對菌株進行生理生化實驗鑒定[24]。

1.4.3.2 野生菌株基因組的提取

吸取37 ℃條件下活化48 h的菌液1 mL，12 000 r/min離心2 min。棄上清液，加180 μL 2 mg/mL溶菌酶，再加20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，55 ℃保溫15 min。加10 μL 10% SDS，渦旋（反復倒置）5 s，再加200 μL Binding Buffer，渦旋5 s，70 ℃保溫10 min。加入95%乙醇200 μL，渦旋5 s。沉淀與絮狀沉淀加入吸附柱，12 000 r/min離心1 min，棄上清液。加漂洗液First Buffer 500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，重復洗滌。加漂洗液Second Buffer 500 μL，12 000 r/min離心1 min，棄上清液。將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒廢液，開蓋，室溫放置10 min。將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附柱中間加100 μL 65 ℃ pH 8.5的TE Buffer洗脫液，室溫放置2～5 min，13 000 r/min離心2 min。

1.4.3.3 菌株16S rDNA聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

使用細菌16S rDNA的通用引物進行擴增。

反應體系：DNA模板10 μL，10×PCR緩沖液5 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，dNTPmix 8 μL，Taq DNA聚合酶（Hifi）1 μL，ddH2O 67 μL，總反應體積為100 μL（混勻后快速離心15 s，50 μL分裝）。

PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性5 min；95℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 155 s，32 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，取擴增產(chǎn)物10 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳[25]。

1.4.3.4 菌株16S rDNA序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI（網(wǎng)址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.）中經(jīng)BLAST后與GenBank庫中已有序列比對分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選及產(chǎn)GABA的性能鑒定

2.1.1 產(chǎn)GABA菌株的分離篩選（初篩）

通過溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）乳酸菌分離培養(yǎng)基選得1 400多株產(chǎn)乳酸的菌株，按1.4.2.2節(jié)所述方法檢測上清液中GABA的含量，將其中GABA產(chǎn)量較高的菌株保存于MRS斜面中留作復篩用。

2.1.2 TYG發(fā)酵液中GABA的定性及定量測定（復篩）

2.1.2.1 TYG發(fā)酵液中GABA的定性測定

發(fā)酵液經(jīng)離心后按1.4.2.1節(jié)所述的方法，進行薄層層析，與GABA標準品比較Rf值，確定其產(chǎn)GABA的能力，結果見圖3。

圖3 薄層層析結果Fig.3 Result of thin layer chromatography

由圖3可知，編號為Dfa301、Dfa432、Dfa650具有與GABA標準品具有相同的Rf值，可以斷定此3 株菌均具有產(chǎn)GABA能力，且層析斑點顏色較深、直徑較大，可以確定其產(chǎn)GABA能力也較高。隨后將這3 株菌株進行GABA定量測定。

2.1.2.2 TYG發(fā)酵液中GABA的定量測定

按1.4.2.2節(jié)所述的方法，以GABA標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，OD640nm為縱坐標繪制標準曲線。統(tǒng)計分析得回歸方程y=1.342 9x－0.007 1，相關系數(shù)R2=0.995 6。證明GABA質(zhì)量濃度在0～0.6 g/L的范圍內(nèi)與OD640nm值相關性較好。隨后按1.4.2.2節(jié)所述的方法進行復篩，復篩結果如表1所示。

表1 各菌株GABA產(chǎn)量Table1 Production of GABA from four isolates

由于Berthelot比色法易受游離氨基的干擾而不適宜測定復雜培養(yǎng)基中GABA的含量[23]，所以將產(chǎn)量最高的編號為Dfa301的菌株送至農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱）進行氨基酸分析及GABA產(chǎn)量測定（圖4），與Berthelot比色法進行對比。

圖4 氨基酸自動分析儀圖譜Fig.4 Profile obtained with automatic amino acid analyzer

由圖4可知，根據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》[27]國標所列舉的方法利用氨基酸自動分析儀測定TYG發(fā)酵液中游離氨基酸總量僅占0.172%；保留時間為8.72 min時出現(xiàn)一個特征峰為谷氨酸，其殘留量為4.167 g/L；保留時間為21.75 min時出現(xiàn)一個特征峰為GABA，其產(chǎn)量為5.833 g/L。與Berthelot比色法比較誤差較小，因此，將編號為Dfa301作為最終實驗菌株對其進行鑒定，其TYG發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量為5.833 g/L。

2.2 菌株的形態(tài)學及生理生化鑒定

2.2.1 菌株的菌落形態(tài)

圖5 菌落形態(tài)特征Fig.5 Colonies of strain Dfa301

由圖5可知，肉眼觀察MRS平板上Dfa301的菌落形態(tài)呈不規(guī)則圓形，初期呈乳白色，直徑在1 mm左右，邊緣有透明狀，表面微微隆起。菌落易于挑取，在液體培養(yǎng)基中呈混濁狀態(tài)，為兼性厭氧型細菌。

2.2.2 菌株的細胞形態(tài)

利用光學顯微鏡觀察菌株Dfa301為短桿狀細菌單個或成對排列；不運動，無鞭毛；不產(chǎn)芽孢。經(jīng)革蘭氏染色確定其為革蘭氏陽性菌（G+），見圖6a。再經(jīng)掃描電鏡，在放大倍數(shù)為7 000 倍條件下觀察，可以清楚的看到Dfa301菌體形態(tài)呈短桿狀，長6.4～15.5 μm，寬2.0～4.1 μm（圖6b）。

圖6 Dfa301菌株革蘭氏染色形態(tài)特征（a）及其電鏡照片（b）Fig.6 Morphology (a) and electron micrograph (b) of strain Dfa301 after Gram staining

2.2.3 菌株Dfa301的生理生化鑒定

表2 菌株生理生化實驗結果Table2 Physiological and biochemical properties of strain Dfa301

由表2可知，將菌株Dfa301于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃活化20 h后，分別接入相應培養(yǎng)基中觀察實驗現(xiàn)象：石蕊牛奶實驗中初期（12～24 h）菌株可以使牛奶凝固，產(chǎn)酸后改變石蕊pH值，使其由藍紫色變?yōu)榧t色，48 h后乳清析出，結果呈陽性；吲哚實驗中乙醚與培養(yǎng)物之間未出現(xiàn)紅色環(huán)狀物，結果呈陰性；接觸酶實驗中在載玻片上的活菌中滴加體積分數(shù)為3% H2O2溶液未產(chǎn)生氣泡，結果呈陰性；檸檬酸鹽實驗中培養(yǎng)基未發(fā)生顏色變化，因此不能利用檸檬酸鹽產(chǎn)酸，結果呈陰性；明膠液化實驗中不能使明膠液化，結果呈陰性；硫化氫實驗中試管壁上的乙酸鉛試紙未變黑，結果呈陰性。將菌株Dfa301劃線于MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落接入糖發(fā)酵管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察實驗現(xiàn)象見表3。

表3 糖發(fā)酵實驗Table3 Sugar fermentation tests

由表3可知，菌株Dfa301不能利用棉子糖、松三糖、鼠李糖產(chǎn)酸，結果呈陰性；其他糖呈陽性。能利用葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸，但不能產(chǎn)氣；能在25 ℃條件下生長，不能在45 ℃條件下生長；能在pH 4.5條件下生長，不能在pH 9.0條件下生長，由此對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，可以初步確定菌株Dfa301為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2.4 16S rDNA序列比對分析及分子生物學鑒定

2.2.4.1 菌株Dfa301基因組的提取及其16S rDNA的擴增

按1.4.3.2節(jié)的方法提取菌株Dfa301的基因組，并以此為模板，采用通用引物擴增16S rDNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖7所示。

圖7 菌株Dfa301的16S rDNA的擴增譜帶Fig.7 Amplified 16S rDNA bands from strain Dfa301

由圖7可知，Dfa301菌的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物出現(xiàn)1條亮帶，其大小為分子質(zhì)量1 500 bp左右。

2.2.4.2 16S rDNA序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，得到菌株Dfa301的16S rDNA序列，用BLAST軟件與GenBank中已發(fā)表的16S rDNA序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，與已公布序列同源性均達99%，隨機選取其中20 株細菌用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，如圖8所示。

圖8 菌株Dfa301的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of Dfa301

由系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）可知，野生細菌Dfa301與已報道的Lactobacillus plantarum親緣性一致，比對同源性均為99%，參照生理生化實驗結果，將Dfa301菌株定名為Lactobacillus plantarum Dfa301，簡寫為LP-Dfa301。

3 結 論

本實驗從黃漿水中篩選出1 400多株菌株，經(jīng)過復篩篩選出3 株高產(chǎn)GABA的菌株。將其中一株產(chǎn)量最高（5.833 g/L，編號LP-Dfa301）的菌株進行形態(tài)學、生理生化鑒定并與GenBank上已提交的16S rDNA進行BLAST比對，表明其歸屬于乳酸桿菌（Lactobacillus）屬。由MEGA 6.0軟件構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明,菌株與Lactobacillus plantarum 16S rDNA序列同源性達99%，且與生理生化實驗結果一致，因此，確定該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。從黃漿水中篩選出產(chǎn)GABA的乳酸菌株，為富含GABA食品級添加劑的開發(fā)及應用提供了基礎，今后可在誘變育種、發(fā)酵工藝優(yōu)化及基因技術等方面著手研究，提高菌株的GABA產(chǎn)量。還可以利用該菌株發(fā)酵黃漿水產(chǎn)GABA，以提高黃漿水的利用價值，避免資源浪費。

[1] 葉硯. 高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲菌種培育及深層發(fā)酵關鍵技術研究[D].金華: 浙江師范大學, 2010: 1-2.

[2] 王建峰, 任舉. γ-氨基丁酸的生理作用與制備方法綜述[J]. 山東化工, 2013, 42(2): 251-252.

[3] BENARROCH E E. Pedunculopontine nucleus functional organization and clinical implication[J]. Neurology, 2013, 80(12): 1148-1155.

[4] PARK K B, OH S H. Production of yogurt with enhanced levels of γ-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract[J]. Bioresource Technology, 2007, 9(8): 1675-1679.

[5] PARK K B, OH S H. Production and characterization of GABA rice yogurt[J]. Journal of Food Sick Biotechnology, 2005, 10: 434.

[6] YOSIPOVITCH G, BERNHARD J D. Clinical practice. Chronic pruritus[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 368(17): 1625-1634.

[7] 李靜, 李霞. γ-氨基丁酸在畜牧生產(chǎn)上的應用[J]. 中國飼料, 2010(3): 5.

[8] 黃桂東, 毛健, 姬中偉, 等. 一株產(chǎn)γ-氨基丁酸植物乳桿菌MJ0301培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 食品科學, 2013, 34(17): 165-166.

[9] 徐冬云, 周立平, 童振宇, 等. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的分離及篩選[J].中國食品添加劑, 2006(2): 105-109.

[10] KOMATSUZAKI N, SHIMA J, KAWAMOTO S. Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods[J]. Food Microbiology, 2005, 22(2): 497-504.

[11] LORCA G L, DEVALDEZ G F. A low-pH-inducible.stationary-phase acid tolerance pesponse in Lactobacillus acidophilus CRL639[J]. Current Microbiology, 2001, 42(1): 21-25.

[12] COTTER P D, GAHAN G M, HILL C. A glutamate decarboxylase system protects Listerria monocytogenes in gastric fluid[J]. Molecular Microbiology, 2001, 40(2): 465-475.

[13] 林親錄, 王婧, 陳海軍. γ-氨基丁酸的研究進展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2008, 24(5): 496-498.

[14] 林謙. γ-氨基丁酸的生理功能概述[J]. 玉林師范學院學報, 2010, 31(2): 62-64.

[15] COTTER P D, HILL C. Surviving the acid test: responses of grampositive bacteria to low pH[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67(3): 429-453.

[16] YOKOYAMA S, HIRAMATSU J I, HAYAKAWA K. Production of γ-aminobutyric acid from alcohol distillery lees by Lactobacillus brevis IFO-12005[J]. Journal of Biomaterials Science Bioengin, 2002, 93(1): 95-97.

[17] 蔣冬花, 后加衡, 黃大年, 等. 酸菜中高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選[J].微生物學雜志, 2007, 27(1): 35-39.

[18] 韓雪, 梁金鐘. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的分離鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(22): 180-183.

[19] 姚子鵬, 吳非. 乳酸菌發(fā)酵黃漿水富集GABA的研究[J]. 食品科技, 2013, 38(4): 7-10.

[20] 李燕, 宋俊梅, 曲靜然. 豆制品廢水的處理及綜合利用[J]. 食品工業(yè)科技, 2002, 23(7): 70-72.

[21] 梁金鐘, 李雯, 王風青. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及誘變育種[J].食品科學, 2013, 34(23): 228-230.

[22] 陸小雪. 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌分離與發(fā)酵條件優(yōu)化及飲料開發(fā)[D].南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2008: 18-20.

[23] 趙宏飛, 宋偉, 裴家偉, 等. 食品中三種γ-氨基丁酸檢測方法比較[J].中國乳品工業(yè), 2008, 36(11): 52; 54.

[24] 布坎南R E, 吉布斯 N E. 伯杰氏細菌鑒定手冊[M]. 中國科學院微生物研究所《伯杰氏細菌鑒定手冊》翻譯組, 譯. 8版. 北京: 科學出版社, 1984: 809-821.

[25] 魏群. 生物化學與分子生物學綜合大實驗[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2007: 8-15.

[26] 張麗娜, 榮昌鶴, 何遠, 等. 常用系統(tǒng)發(fā)育樹構建算法和軟件鳥瞰[J].動物學研究, 2013, 34(6): 640-650.

[27] GB/T 5009.124—2003 食品中氨基酸的測定[S].

Screening of Lactic Acid Bacteria with High Yield of Gamma-Aminobutyric Acid from Yellow Serofluid, the Wastewater from Tofu Production

LIU Jia-rong, LIANG Jin-zhong*
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

After primary screening and rescreening, a high-yield strain producing γ-aminobutyric acid (GABA) was isolated from yellow serofluid, the wastewater from tofu production. Morphology analysis, physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequences in GenBank indicated that the strain belonged to the Lactobacillus genus. Then, the phylogenic tree generated by MEGA 6.0 software revealed that it was closely related to Lactobacillus plantarum with a similarity of 99%, and numbered LP-Dfa301. In the fermentation broth, GABA production could reach 5.833 g/L.

γ-aminobutyric acid (GABA); Lactobacillus; yellow serofluid; 16S rDNA; phylogenic tree

Q939.97

A

1002-6630（2014）23-0221-05

10.7506/spkx1002-6630-201423043

2014-06-22

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團隊建設計劃項目（2010td04）

劉佳榮（1989—），女，碩士，研究方向為微生物學與發(fā)酵工程。E-mail：183650482@qq.com

*通信作者：梁金鐘（1957—），男，教授，本科，研究方向為微生物學與發(fā)酵工程。E-mail：Ljz2050@126.com