孫文靜，陳義倫，吳茂玉，王鳳忠，黃坤勇，朱宇竹，周 波,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究 院，山東 濟(jì)南 250014；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；4.中寧牧光生物 科技有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100）

自然發(fā)酵蘋(píng)果渣中的微生物區(qū)系分析

孫文靜1，陳義倫1，吳茂玉2，王鳳忠3，黃坤勇4，朱宇竹1，周 波1,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社濟(jì)南果品研究 院，山東 濟(jì)南 250014；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；4.中寧牧光生物 科技有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100）

以自然發(fā)酵的蘋(píng)果渣為對(duì)象，采用選擇平板分離技術(shù)，對(duì)其不同層次的微生物區(qū)系組成進(jìn)行分析。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定，結(jié)合ITS區(qū)、26S r RNA和16S r RNA基因序列分析等多 相分類(lèi)法對(duì)分離獲得的微生物進(jìn)行鑒定，研究蘋(píng)果渣不同溫度層中的微生物區(qū)系組成。結(jié)果表明：自然發(fā)酵蘋(píng)果渣中主要微生物組成為酵母菌和乳酸菌，從28、37、45、50 ℃這4 個(gè)溫度層中分離得到 10 株菌，4 個(gè)溫度層的優(yōu)勢(shì)菌分別鑒定為黑曲霉、乳酸鏈球菌、馬克斯克魯維酵母和東方伊薩酵母。

自然發(fā)酵；蘋(píng)果渣；微生物區(qū)系；多相分類(lèi)法

蘋(píng)果渣是蘋(píng)果加工業(yè)的副產(chǎn)物，主要由果皮、果核和殘余果肉組成，約占鮮果質(zhì)量的25%[1]。我國(guó)是世界上蘋(píng)果生產(chǎn)第一大國(guó)，蘋(píng)果種植規(guī)模和總產(chǎn)量占世界蘋(píng)果總生產(chǎn)水平的1/3左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2009年我國(guó)的年產(chǎn)量約達(dá)3 300萬(wàn) t，2012年產(chǎn)量達(dá)到3 800萬(wàn) t，約占世界蘋(píng)果總產(chǎn)量的63.3%[2]。近年來(lái)，隨著我國(guó)蘋(píng)果加工業(yè)的飛速發(fā)展，每年約有100多萬(wàn)噸蘋(píng)果渣產(chǎn)生[3]。蘋(píng)果渣含有可溶性糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和果酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，果膠、不可溶性膳食纖維等物質(zhì)含量非常豐富[4-5]。作為果汁業(yè)的主要副產(chǎn)品，經(jīng)深加工后可提高蘋(píng)果渣的附加產(chǎn)值，減輕環(huán)境污染，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，是一種可以資源化利用的加工副產(chǎn)物。

目前，蘋(píng)果渣主要為直接干燥或發(fā)酵作飼料[6]，也用于提取果膠[7]、膳食纖維[8]及作為微生物的生長(zhǎng)基質(zhì)來(lái)生產(chǎn)酒精[9]、檸檬酸[10]、低聚糖[11]等，還可經(jīng)微生物發(fā)酵作為生物有機(jī)肥使用。蘋(píng)果渣含有較高水分，易被微生物浸染，發(fā)霉、腐爛變質(zhì)，加工利用前大量的蘋(píng)果渣在貯存?zhèn)溆闷陂g會(huì)發(fā)生自然發(fā)酵現(xiàn)象，給其加工產(chǎn)品帶來(lái)安全性影響。2002年李志西等[6]曾分析過(guò)發(fā)酵蘋(píng)果渣中的微生物組成，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)自然發(fā)酵蘋(píng)果渣的微生物區(qū)系分析的研究較少；本實(shí)驗(yàn)主要以自然發(fā)酵狀態(tài)下蘋(píng)果渣為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行微生物組成分析，以期闡明自然發(fā)酵蘋(píng)果渣微生物組成特征，為深入研究自然發(fā)酵蘋(píng)果渣應(yīng)用的安全性，提升產(chǎn)業(yè)價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋(píng)果渣樣品由中寧牧光生物科技有限公司提供。濃縮果汁廠加工產(chǎn)生的新鮮果渣（9月1日）經(jīng)過(guò)約一個(gè)月（10月5日）的自然堆積發(fā)酵（厚度約1.5 m，pH 3.0～3.5），形成明顯分層。自然發(fā)酵蘋(píng)果渣的基本性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣的基本性質(zhì)Table1 Basic properties of naturally fermented apple pomace

葡萄糖、蔗糖、無(wú)水乙酸鈉、檸檬酸銨、KNO3、NaCl、MgSO4、FeSO4（均為分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01試劑盒 美國(guó)Omega Bio-Tek公司；TIANamp Yeast DNA Kit DP307試劑盒、TIANamp Bacteria DNA Kit DP302試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

真菌分離培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 3.5。

細(xì)菌分離培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 3.5。

放線菌分離培養(yǎng)基（高氏Ⅰ號(hào)）：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 3.5。

真菌鑒定及保藏培養(yǎng)基（CA）：NaNO33.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

乳酸菌保藏培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、K2HPO42.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、瓊脂20 g、碳酸鈣20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2。

1.3 儀器與設(shè)備

Nikon YS2電子顯微鏡 日本尼康光學(xué)儀器有限公司；TGL-16B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C型數(shù)字式酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；HH-I數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；T-Gradient PCR儀 德國(guó)Biometra公司；GelDoc-It凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司。

1.4 方法

1.4.1 蘋(píng)果渣中微生物組成分析[12-13]

稱取自然發(fā)酵的蘋(píng)果渣10 g于90 mL無(wú)菌水中，振蕩搖勻后進(jìn)行系列稀釋?zhuān)∵m宜濃度分別涂布于PDA、LB和高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上，按分層的溫度要求倒置培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.2 不同層次中微生物的分離與純化

不同層次微生物分離：分別稱取10 g各層次的蘋(píng)果渣于90 mL無(wú)菌水中，振蕩混勻后進(jìn)行系列稀釋?zhuān)∵m宜濃度涂布于PDA、LB和高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上，按自然發(fā)酵蘋(píng)果渣的層次溫度倒置培養(yǎng)。

菌種純化和保藏：挑取不同形態(tài)的菌體作平板劃線純化，將純化單一的菌體于斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保藏備用。

1.4.3 菌種鑒定

對(duì)所獲得的菌株通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定，結(jié)合分子生物學(xué)基因序列分析等多相分類(lèi)法進(jìn)行鑒定。

1.4.3.1 形態(tài)學(xué)及顯微形態(tài)觀察

將分離所得微生物接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，進(jìn)行菌落形態(tài)和顯微鏡觀察并記錄。

1.4.3.2 生理生化分析

真菌的生理生化鑒定：根據(jù)文獻(xiàn)[14-16]進(jìn)行生理生化鑒定。主要指標(biāo)包括碳源利用實(shí)驗(yàn)、氮源利用實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

細(xì)菌的生理生化鑒定：根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]進(jìn)行生理生化鑒定。主要指標(biāo)包括革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原、明膠液化實(shí)驗(yàn)和碳源利用實(shí)驗(yàn)。

1.4.3.3 分子生物學(xué)鑒定

霉菌的分子鑒定：將分離純化的霉菌接種于PDA固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)3～5 d，收集菌體至研缽中，加液氮充分研磨后，用OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01試劑盒進(jìn)行DNA提取。以基因組DNA為模板，采用霉菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行ITS區(qū)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增[19]。

酵母菌的分子鑒定：將分離純化的酵母菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18 h，用TIANamp Yeast DNA Kit DP307試劑盒進(jìn)行DNA提取。以基因組DNA為模板，采用酵母菌通用引物NL1和NL4進(jìn)行26S rRNA的PCR擴(kuò)增[20]。

細(xì)菌的分子鑒定：將分離純化的細(xì)菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18 h，用TIANamp Bacteria DNA Kit DP302試劑盒進(jìn)行DNA提取。以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F和1495R進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增[21]。

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在軟件DNAMAN上進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）中的GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，采用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣中微生物組成分析

采用平板稀釋涂布法，對(duì)樣品進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)得到的菌數(shù)結(jié)果為：霉菌3.5×103CFU/g、酵母菌2.5×107CFU/g、細(xì)菌1.6×107CFU/g，放線菌未檢出；由此可知自然發(fā)酵的蘋(píng)果渣中的主體微生物為酵母菌和乳酸菌，其次是霉菌，未分離到放線菌。

表2 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣不同層次中的優(yōu)勢(shì)菌株Table2 Dominant strains of different layers in naturally fermented apple pomace

由表2可知，在第一層中分離得到3 株菌株，分別編號(hào)為2-1、2-2和2-3，由菌落數(shù)可知2-1為優(yōu)勢(shì)菌株，其菌落形態(tài)如圖1a所示；在第二層中分離得到4 株菌株，分別編號(hào)為3-1、3-2、3-3和3-4，由菌落數(shù)可知3-2為優(yōu)勢(shì)菌株，其菌落形態(tài)如圖1b所示；在第三層中分離得到2 株菌株，分別編號(hào)為4-1和4-2，由菌落數(shù)可知4-1為優(yōu)勢(shì)菌株，其菌落形態(tài)如圖1c所示；在第四層中分離得到一株菌株，編號(hào)為5-1，其菌落形態(tài)如圖1d所示。

圖1 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣不同層次優(yōu)勢(shì)菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the dominant stains from different layers in naturally fermen ted apple pomace

2.2 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣中分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

自然發(fā)酵蘋(píng)果渣分離所得菌株的形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)表3。由菌落形態(tài)可知，菌株2-1、2-2、3-1和3-3在培養(yǎng)基上有大量菌絲，叢生，上有不同顏色的孢子；菌株2-3、3-4、4-1和5-1的菌落圓形，表面光滑濕潤(rùn)，顏色呈白色或乳白色，表面凸起，有淡香味，經(jīng)染色觀察為細(xì)胞圓形，出芽生殖；菌株3-2和4-2的菌落濕潤(rùn)，圓形，經(jīng)染色觀察為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈球形，成對(duì)或成鏈存在。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[15]、《真菌鑒定手冊(cè)》[16]和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[18]，初步認(rèn)為菌株2-1、2-2、3-1和3-3為霉菌；菌株2-3、3-4、4-1和5-1為酵母菌；菌株3-2和4-2為細(xì)菌。對(duì)分離所得的10 株菌株進(jìn)行生理生化鑒定，進(jìn)一步確定其分類(lèi)地位。

表3 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣中分離所得菌株的形態(tài)學(xué)特征Table3 Morphological characteristics of the strains isolated from naturally fermented apple pomace

由形態(tài)學(xué)和顯微觀察可知，菌株2-1菌落初生白色菌絲，其上密生一層黑色粉粒，邊緣不規(guī)則，菌絲頂囊球形，分生孢子灰黑色，大而呈球形，分生孢子梗光滑，小梗雙層；菌株2-2菌落白色，扁平，菌絲匍匐，叢白粉狀，分生孢子梗直立，較短，頂生長(zhǎng)串狀的分生孢子，為圓筒形或長(zhǎng)筒形的節(jié)孢子狀；菌株3-1菌落灰綠色，中心有少許絮狀突起，反面黃綠色，有輕霉味，分生孢子穗圓筒形，分生孢子梗光滑，頂囊燒瓶狀，分生孢子球形；菌株3-3菌落綠色，孢子叢常帶綠色，分生孢子梗有橫隔，光滑，頂端不對(duì)稱掃帚狀，分生孢子球形或橢圓形，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[16]初步認(rèn)為菌株2-1和3-1為曲霉屬，菌株2-2為地霉屬，菌株3-3為青霉屬。

2.3 生理生化鑒定

2.3.1 細(xì)菌的生理生化鑒定

表4 細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果Table4 Physiological and biochemical identification of bacteria

由表4可知，菌株3-2和4-1革蘭氏染色均為陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)酸為陽(yáng)性，均發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖和甘露醇，菌株4-1還發(fā)酵阿拉伯糖和山梨醇。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[18]，初步認(rèn)為菌株3-2為鏈球菌屬和4-2為乳桿菌屬。

2.3.2 酵母菌的生理生化鑒定

菌株2-3、3-3、4-1和5-1無(wú)菌絲和孢子，菌落形態(tài)不同于霉菌，經(jīng)過(guò)顯微觀察，細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，生殖方式為芽殖，有淡香味。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[15]和《真菌鑒定手冊(cè)》[16]，初步認(rèn)為菌株2-3、3-3、4-1和5-1為酵母菌，對(duì)其進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5、6。

表5 酵母菌糖發(fā)酵鑒定結(jié)果Table5 Results of carbohydrate fermentation tests for yeasts

表6 酵母菌碳源同化實(shí)驗(yàn)及氮源同化結(jié)果Table6 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for yeasts

由表5、6可知，菌株2-3和4-1全部發(fā)酵乳糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖，不發(fā)酵蜜二糖和海藻糖；菌株3-4發(fā)酵葡萄糖、海藻糖和半乳糖，其余糖不發(fā)酵；菌株5-1只發(fā)酵葡萄糖。菌株全部同化乙醇，不同化麥芽糖和淀粉，在單一氮源培養(yǎng)基中全部不同化硝酸鈉和亞硝酸銨；菌株3-4可同化D-木糖；菌株2-3和4-1可同化棉子糖和乳糖。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[15]和《真菌鑒定手冊(cè)》[16]，初步認(rèn)為菌株2-3和4-1為克魯維酵母屬，菌株3-4為假絲酵母屬和菌株5-1為伊薩酵母屬。對(duì)分離得到的10 株菌株進(jìn)行分子生物學(xué)分類(lèi)鑒定，進(jìn)一步確定其分類(lèi)地位。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 序列比對(duì)結(jié)果與分析

利用3 種試劑盒提取10 株菌株的DNA，PCR擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物送至北京華大基因進(jìn)行測(cè)序，利用DNAMAN將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同緣性超過(guò)99%的基因序列。綜合形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征和分子生物學(xué)基因序列分析，分離所得10 株菌株的鑒定結(jié)果見(jiàn)表7。該菌株已被山東農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（Agricultural Microbiology Culture Collection，AMCC）收錄。

表7 自然發(fā)酵蘋(píng)果渣分離所得菌株的鑒定結(jié)果Table7 Identification of the strains in naturally fermented apple pomace

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序，于GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同緣性超過(guò)99%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2～4所示。

圖2 分離所得細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of isolated bacteria

圖3 分離所得霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of isolated molds

圖4 分離所得酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of isolated yeasts

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌株2-1與Aspergillus niger，菌株2-2與Galactomyces geotrichum，菌株2-3與4-1與Kluyveromyces marxianus，菌株3-1與Aspergillus fumigatus，菌株3-2與Lactococus lactis，菌株3-3與Penicillium paneum，菌株3-4與Candida tartarivorans，菌株4-2與Lactobacillus plantarum，菌株5-1與Issatchenkia orientalis的同源性最高，與比對(duì)結(jié)果基本一致。綜合形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特征和分子生物學(xué)基因序列分析，最終確定菌株2-1為Aspergillus niger，菌株2-2為Galactomyces geotrichum，菌株2-3與4-1為Kluyveromyces marxianus，菌株3-1為Aspergillus fumigatus，菌株3-2為L(zhǎng)actococus lactis，菌株3-3為Penicillium paneum，菌株3-4為Candida tartarivorans，菌株4-2為L(zhǎng)actobacillus plantarum，菌株5-1為Issatchenkia orientalis。該菌株已被山東農(nóng)業(yè)微生物菌種資源保藏與利用中心（AMCC）收錄。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)表明，自然發(fā)酵蘋(píng)果渣中的主體微生物為酵母菌和乳酸菌，其次為霉菌，未分離到放線菌；除自然發(fā)酵蘋(píng)果渣表層中存在少量霉菌，其余與李志西等[6]分析的結(jié)果基本一致。自然發(fā)酵蘋(píng)果渣不同層次優(yōu)勢(shì)菌群不同，從第一層篩選出3 株菌，其優(yōu)勢(shì)菌群為黑曲霉（AMCC 300003）；第二層篩選出4 株菌，其優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸鏈球菌（AMCC 100047）；第三層篩選出2 株菌，其優(yōu)勢(shì)菌群為馬克斯克魯維酵母（AMCC 200010）；第四層篩選出1 株菌，優(yōu)勢(shì)菌群為東方伊薩酵母（AMCC 200014）。

對(duì)分離所得的10 株菌株通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定和分子生物學(xué)等多相分類(lèi)法進(jìn)行了鑒定，初步鑒定結(jié)果如下：5 株為酵母屬，2 株為乳酸菌屬，2 株為曲霉屬，1 株為青霉屬。這些菌株可能來(lái)源于果汁加工過(guò)程中果渣本身存在的，或是果渣運(yùn)輸過(guò)程中運(yùn)輸工具上的，也可能來(lái)自果渣貯藏環(huán)境的，這些菌株在生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步深入研究。

自然發(fā)酵狀態(tài)下蘋(píng)果渣的這種層次和菌群結(jié)構(gòu)的形成可能由以下因素決定：氧分壓、溫度和pH值（3.0～3.5）。這種特殊的果渣菌群結(jié)構(gòu)是特定環(huán)境條件和營(yíng)養(yǎng)條件共同決定的。

本實(shí)驗(yàn)分離菌株中，酵母屬和乳酸菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)微生態(tài)產(chǎn)品，對(duì)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖具有良好的積極促進(jìn)作用；蘋(píng)果渣淺層中存在少量的曲霉屬和青霉屬菌株，作為動(dòng)物飼用是否存在安全隱患，還需進(jìn)一步深入研究；建議表層約10%的蘋(píng)果渣去除之后再使用，以確保自然發(fā)酵果渣飼用的安全性。

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Analysis of Micr oflora Profile in Naturally Fermented Apple Pomace

SUN Wen-jing1, CHEN Yi-lun1, WU Mao-yu2, WANG Feng-zhong3, HUANG Kun-yong4, ZHU Yu-zhu1, ZHOU Bo1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2. Jinan Fruit Research Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooper atives, Jinan 250014, China; 3. Institute of Agro-products Processing Sciences and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 4. Biotechnology Corporation of Zhongning Mu-guang, Zhongwei 755100, China)

In order to investigate the microflora in different temperature layers of naturally fermented apple pomace, the microorganisms were obtained by selective plate method and identified by morphology observation, physiological and biochemical characteristics and molecular biological techniques (ITS region, 26S rRNA and 16S rRNA gene sequence analysis). The results indicated that the major microorganisms of spontaneously fermented apple pomace included yeast and Lactobacillus, and ten strains were isolated from four temperature layers. The dominant bacteria from four temperature layers were identified as Aspergillus niger, Lactococcus lactis, Kluyveromyces marxianus and Issatchenkia orientalis, respectively.

natural fermentation; apple pomace; microflora; polyphasic taxonomy

Q939.9

A

1002-6630（2014）23-0193-06

10.7506/spkx1002-6630-201423038

2013-12-02

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD11B01；2012BAD31B01）

孫文靜（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏和微生物發(fā)酵。E-mail：sunwenjing9178@126.com

*通信作者：周波（1972—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源。E-mail：zhoubo2798@163.com