侯曉瑞，王 婧，楊學(xué)山，盛文軍，祝 霞，韓舜愈,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選

侯曉瑞1,2,3，王 婧1,2,3，楊學(xué)山4，盛文軍1,2,3，祝 霞1,2,3，韓舜愈1,2,3,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)成熟葡萄漿果自然發(fā)酵過程中分離得到的115 株酵母菌株為出發(fā)菌株，采用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物的平板初篩，搖瓶復(fù)篩，對高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株進行WL營養(yǎng)培養(yǎng)基和賴氨酸培養(yǎng)基初步分類以及26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析。結(jié)果表明：6 株酵母β-葡萄糖苷酶活性與商業(yè)酵母ICV-D254酶活性相似，酶活力可達（51.40±4.74） mU/mL，其中菌株QLFE、MQFEH-1、MQFSC-3、MQFEH-2和MQFSM-3為釀酒酵母屬，菌株QLFE-4為梅奇酵母屬，與分子鑒定結(jié)果一致。

酵母篩選；β-葡萄糖苷酶活性；鑒定；26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

β-葡萄糖苷酶能催化烷基糖苷、芳基糖苷、纖維素和纖維低聚糖等結(jié)合于糖鏈末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵水解，使其釋放出游離的具有香氣的糖苷配體[1-3]。酵母菌是葡萄酒釀造過程中的主要微生物，原產(chǎn)地環(huán)境中可篩選出能充分展現(xiàn)該地域特色的酵母，并釀造出風(fēng)格獨特、具有品種典型性的葡萄酒[4]。近年來，地域特色酵母菌株的應(yīng)用對提高葡萄酒色澤、香氣、結(jié)構(gòu)和其他工藝性能等方面具有積極影響[5-6]。釀酒過程中，酵母次級代謝產(chǎn)物β-葡萄糖苷酶能分解結(jié)合態(tài)芳香前體物質(zhì)，對葡萄酒香氣的提升具有十分重要的作用[7]。因此，篩選出具有地域特色的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株對提升產(chǎn)區(qū)葡萄酒品質(zhì)具有積極的意義。

近幾年，對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母方面的研究一直是國內(nèi)外研究熱點之一。薛菊蘭等[8]利用定性培養(yǎng)基對436 株慕薩萊思釀酒酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性進行研究，篩選到10 株β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株。Pérez等[9]利用七葉苷甘油瓊脂培養(yǎng)基分離得到30 株具有β-葡萄糖苷酶活性的釀酒酵母菌株。Vernocchi等[10]篩選出兩株高產(chǎn)胞外β-葡萄糖苷酶的野生釀酒酵母，且具有低殘?zhí)呛透弋a(chǎn)橙花叔醇及香茅醇等釀酒特性。

本實驗采用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）法從甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)成熟葡萄漿果自然發(fā)酵過程中分離得到野生酵母菌株中篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株，利用WL營養(yǎng)培養(yǎng)基和賴氨酸培養(yǎng)基對其進行初步分類以及分子鑒定。旨在得到具有地區(qū)特色的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株，為本地區(qū)葡萄酒釀造酵母資源庫的建設(shè)奠定一定基礎(chǔ)，為地區(qū)特色優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

115 株酵母菌株：從甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)4 個釀酒葡萄種植基地（甘肅威龍酒業(yè)有限責任公司民勤蘇武山葡萄莊園、甘肅黃羊鎮(zhèn)武威莫高葡萄莊園、甘肅張掖祁連酒業(yè)有限責任公司張掖高臺葡萄莊園、甘肅嘉峪關(guān)紫軒酒業(yè)有限責任公司嘉峪關(guān)葡萄莊園）成熟葡萄漿果自然發(fā)酵液中分離得到，保存于甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室。

商業(yè)酵母ICV-D254 法國諾盟公司；p-NPG 美國Sigma公司；對硝基苯酚 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、檸檬酸、磷酸二氫鈉、碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CPJ214型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；H2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌 20 min。

初篩培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌 20 min，在溫度降到 60～70 ℃左右加入1 g/L p-NPG。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，121 ℃滅菌 20 min。

WL（Wallerstein Laboratory）營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g/L、胰蛋白胨5 g/L、葡萄糖50 g/L、瓊脂20 g/L；儲液A與儲液B混合，調(diào)pH值至 6.5，滅菌后加儲液C。儲液A：磷酸二氫鉀5.5 g、氯化鉀4.25 g、氯化鈣1.25 g、硫酸鎂1.25 g，定容至400 mL，使用時按40 mL/1 000 mL比例添加；儲液B：氯化鐵0.25 g、硫酸錳0.25 g，定容至100 mL，使用時按1 mL/1 000 mL比例添加；儲液C：0.44 g溴甲酚綠溶于100 mL 50%乙醇溶液中，使用時按1 mL/1 000 mL比例添加。

賴氨酸培養(yǎng)基：稱取66 g培養(yǎng)基粉末溶于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃滅菌20 min，傾注平板，備用。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選[4,6]

初篩：由于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株在以p-NPG為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上能水解p-NPG生成對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP），在Na2CO3作用下可形成黃色光圈。光圈顏色深淺能初步反映酶活性高低。因此，將菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后接種在篩選培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h，噴1 mol/L Na2CO3進行顯色，黃色光圈明顯的菌株即為目標菌株，接種于斜面4 ℃保存，作為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株進行復(fù)篩。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株活化后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為β-葡萄糖苷酶粗酶液，用于酶活性測定，從中篩選酶活力較高的菌株。

1.4.2 β-葡萄糖苷酶活性的測定

1.4.2.1 標準曲線的繪制[6]

稱取對硝基苯酚139.0 mg，蒸餾水定容至1 000 mL，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于100 mL容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻。以蒸餾水作為空白，于400 nm波長處測其吸光度。對硝基苯酚在堿性條件下顯黃色，在一定范圍里其濃度與吸光度成正比。以對硝基苯酚質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到對硝基苯酚標準曲線回歸方程：y= 19.882x+0.001 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，吸光度與對硝基苯酚含量成線性關(guān)系。

1.4.2.2 β-葡萄糖苷酶活性測定[4]

取0.1 mL粗酶液與 0.2 mL 35 mmol/L p-NPG（pH 5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制）混勻，50 ℃保溫 10 min，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)并顯色，于400 nm波長處測定吸光度。以加熱失活的酶液按照同樣處理作為空白。

酶活力單位定義：酶活力單位（U）定義為pH 5.0、50 ℃反應(yīng)條件下，1 min水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol p-NP所需要的酶量。

1.4.3 菌株初步分類

1.4.3.1 WL固體培養(yǎng)基聚類分析[11]

將供試菌株活化，劃線接種于WL營養(yǎng)培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72～96 h，根據(jù)菌落的大小、顏色、形態(tài)等將菌株進行初步分類。Hemandez等[12]研究表明，WL培養(yǎng)基可以對一些常見葡萄酒相關(guān)酵母進行初步分類，不同屬的酵母可以在此培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)（表1）。

表1 酵母在WL營養(yǎng)培養(yǎng)基菌落特征[13]Table1 Yeast colony characteristics on WL nutrient medium[13]

1.4.3.2 釀酒酵母與非釀酒酵母的初步鑒定[14]

將供試菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基活化24 h后，轉(zhuǎn)接到5 mL無菌水中進行饑餓處理，120 h后接種到賴氨酸培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)120 h后觀察菌落生長情況，能夠在賴氨酸培養(yǎng)基上生長的酵母菌株屬于非釀酒酵母，無法生長的為釀酒酵母。

1.4.4 26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

1.4.4.1 菌株DNA提取[15]

從新鮮平板中挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到一個含有100 mL LB培養(yǎng)基的1 L燒瓶中。于37 ℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h（旋轉(zhuǎn)搖床，300 r/min）。無菌條件下轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50 mL聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻至0 ℃。4 ℃、4 000 r/min離心10 min，回收細胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。以10 mL用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重懸每份沉淀，放置于冰上。4 ℃、4 000 r/min離心10 min，回收細胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。每50 mL初始培養(yǎng)物用2 mL用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（含體積分數(shù)20%甘油）重懸每份細胞沉淀。將細胞分裝成小份（100 μL/支），置于－70 ℃條件下凍存。

1.4.4.2 26S rDNA D1/D2區(qū)域PCR擴增和測序[16]

2 6 S r D N A D1/D2區(qū)域的擴增引物：N L 1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。擴增條件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 25 s；55 ℃ 25 s；72 ℃ 1 min；30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 反應(yīng)體系：5×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL；2.5 mmol/L dNTPs 1 μL；Taq酶0.2 μL，Template 0.5 μL；10 μmol/L 正向和反向引物各0.5 μL；加雙蒸水至25 μL。取5 μL產(chǎn)物用 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢驗合格后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.4.4.3 序列分析

測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用Blast程序進行同源序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的初篩

將115 株出發(fā)菌株活化后分別接種于初篩平板培養(yǎng)后，黃色透明圈直徑大小及顏色深淺有明顯差異，因此，根據(jù)菌落是否有黃色光圈及顏色深淺，將菌株產(chǎn)酶能力初步劃分為4 個等級：A為不產(chǎn)酶、B為弱產(chǎn)酶、C為中等產(chǎn)酶、D為較強產(chǎn)酶，見圖2。選取初篩菌株中透明圈直徑較大、顏色較深（等級劃分為D）的44 株菌株進行液體發(fā)酵，測定發(fā)酵上清液的酶活力大小進行復(fù)篩。

圖1 產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基顯色Fig. 1 Identification of β-glucosidase activity produced in media by color development

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母酶活性特性分布

由表2可知，不同產(chǎn)區(qū)不同發(fā)酵期分離得到的115 株酵母菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力大小主要集中在中等酶活性（C）和較高酶活性（D）兩個級別，并且產(chǎn)酶菌株以發(fā)酵前期為主，占出發(fā)菌株的56%，中期和末期均為22%。從葡萄酒產(chǎn)區(qū)來看，從民勤產(chǎn)區(qū)分離到的產(chǎn)酶菌株占36%，武威、張掖和嘉峪關(guān)產(chǎn)區(qū)分離到的產(chǎn)酶菌株分別為23%、23%和18%。表明在發(fā)酵前期，民勤、武威和張掖產(chǎn)區(qū)得到的產(chǎn)酶菌株較多，且活性以中等為最多。發(fā)酵中期，菌株以產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性較強為主，產(chǎn)區(qū)分布相當。發(fā)酵后期，來自民勤產(chǎn)區(qū)的出發(fā)菌株中產(chǎn)酶菌株較明顯，且發(fā)酵后期得到的酵母菌株β-葡萄糖苷酶活性較高。說明酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性高低與發(fā)酵過程及生態(tài)環(huán)境有一定關(guān)系，其相關(guān)性有待進一步研究。

表2 產(chǎn)-葡萄糖苷酶野生酵母在不同產(chǎn)區(qū)不同發(fā)酵期的分布Table2 Distribution of wild yeast strains with -glucosidase activity from grape berries grown in different regions at different fermentation stages

2.3 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的復(fù)篩

對初篩中顯色較強（D級別）的44 株菌株采用p-NPG法進行β-葡萄糖苷酶活性測定，并以商業(yè)酵母ICV-D254為對照，結(jié)果有6 株酵母菌株酶活性與商業(yè)釀酒酵母相當，結(jié)果見表3。菌株MQFSC-3和QLFE具有高β-葡萄糖苷酶活性且高于對照商業(yè)釀酒酵母ICV，其次菌株QLFE-4、MQFEH-1、MQFEH-2和 MQFSM-3活性與商業(yè)酵母相當。

表3 不同酵母菌株β葡萄糖苷酶活性Table3 -glucosidase activities of different yeast strains

2.4 WL營養(yǎng)培養(yǎng)基聚類分析

將復(fù)篩到的6 株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株接種于WL培養(yǎng)基，其菌落特征見表4。通過表1與表4的對照，菌株QLFE、MQFEH-1、MQFSC-3、MQFEH-2和MQFSM-3為釀酒酵母屬，菌株QLFE-4為梅奇酵母屬。

表4 WL營養(yǎng)培養(yǎng)基和賴氨酸培養(yǎng)基鑒定結(jié)果Table4 Colony characteristics on WL nutrient medium and growth characteristics in lysine medium

2.5 釀酒酵母與非釀酒酵母的初步鑒定

賴氨酸培養(yǎng)基是根據(jù)釀酒酵母不能利用賴氨酸作為唯一氮源的特性進行鑒定的[14]。將篩選到的6 株酵母菌株接種到賴氨酸培養(yǎng)基，觀察生長情況。結(jié)果顯示，菌株QLFE-4能在賴氨酸培養(yǎng)基上較好的生長，而菌株QLFE、MQFEH-1、MQFSC-3、MQFEH-2和MQFSM-3無法生長，如表4所示，由此也說明了QLFE、MQFEH-1、MQFSC-3、MQFEH-2和MQFSM-3為釀酒酵母，而QLFE-4為非釀酒酵母，這與WL培養(yǎng)基鑒定結(jié)果相符。

2.6 26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

圖2 酵母菌株的PCR擴增電泳Fig.2 PCR amplification of yeast strains

表5 酵母菌株 26S rDNAD1/D2測序結(jié)果Table5 Sequence analysis of the 26S rDNA D1/D2 domain of yeast strains

通過PCR方法分別擴增MQFSC-3、QLFE、QLFE-4和MQFSM-3（MQFEH-1和MQFEH-2與其重復(fù)）的26S rDNA D1/D2區(qū)（圖2），PCR產(chǎn)物純化后測序，結(jié)果見表5。測序結(jié)果與GenBank中已鑒定的酵母26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對，菌株QLFE、MQFSC-3和MQFSM-3與Saccharomyces cerevisiae的同源性為100%，初步鑒定為釀酒酵母，菌株QLFE-4與Metschnikowia aff. fructicola的同源性為100%，初步鑒定為核果梅奇酵母。

3 結(jié) 論

以p-NPG為唯一碳源，對自然發(fā)酵過程中分離得到的115 株酵母菌株的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力進行初步篩選及酶活性測定，通過與商業(yè)酵母菌株ICV-D254對比發(fā)現(xiàn)6 株酵母菌株酶活性較高，其中菌株MQFSC-3和QLFE高于對照商業(yè)酵母，分別為51.40、50.43 mU/mL，具有較好的應(yīng)用前景。產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母活性與其分離地點及分離時間存在必然聯(lián)系，總體來說，高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母主要集中在發(fā)酵前期以及民勤產(chǎn)區(qū)。

本實驗利用WL培養(yǎng)基結(jié)合賴氨酸培養(yǎng)基對菌株進行初步分類鑒定，通過進一步26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析驗證，并對結(jié)果進行比較，其結(jié)果說明WL培養(yǎng)基和賴氨酸培養(yǎng)基篩選準確性較高。QLFE、MQFEH-1、MQFSC-3、MQFEH-2和MQFSM-3為釀酒酵母，QLFE-4為核果梅奇酵母。但WL培養(yǎng)基結(jié)合賴氨酸培養(yǎng)基篩選需要注意兩方面：1）利用WL培養(yǎng)基篩選時要認真觀察菌落形態(tài)，否則會因為判斷錯誤而導(dǎo)致失誤；2）分析賴氨酸培養(yǎng)基篩選過程中饑餓處理時間及菌株生存能力對結(jié)果會產(chǎn)生一定的影響。

本實驗結(jié)果初步揭示了甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生酵母的分布情況，并驗證了WL培養(yǎng)基結(jié)合賴氨酸培養(yǎng)基對酵母篩選的適用性。為篩選具有地區(qū)特色產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生酵母提供了理論基礎(chǔ)，為本地區(qū)葡萄酒釀造酵母資源庫的建設(shè)提供參考依據(jù)，并為其在葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Screening of Yeast Strains Producing β-Glucosidase from Hexi Corridor Wine-Producing Regions of Gansu Province

HOU Xiao-rui1,2,3, WANG Jing1,2,3, YANG Xue-shan4, SHENG Wen-jun1,2,3, ZHU Xia1,2,3, HAN Shun-yu1,2,3,*
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Key Laboratory of Viticulture and Enology in Gansu Province, Lanzhou 730070, China; 3. Research and Development Center of Wine Industry Technology in Gansu Province, Lanzhou 730070, China; 4. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Totally 115 yeast strains isolated from spontaneously fermented ripe grape berries from Hexi Corridor wineproducing regions of Gansu province were subjected to two-round screening on plates followed by in shaking flasks using p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-NPG) as a substrate for β-glucosidase activity. The strains with higher β-glucosidase activity were subjected to taxonomic identification using WL nutrient medium and lysine medium, and sequence analysis of the 26S rDNA D1/D2 domain. Six yeast isolates with β-glucosidase activity similar to that of commercial yeast ICV-D254, (51.40±4.74) mU/mL, were obtained. Strains QLFE, MQFEH-1, MQFSC-3, MQFEH-2 and MQFSM-3 were identified as Saccharomyces cerevisiae, and QLFE-4 as Metschnikowia. These identification results were in accordance with those from sequence analysis of the 26S rDNA D1/D2domain.

yeast screening; β-glucosidase activity; identification; sequence analysis of the 26S rDNA D1/D2domain

TS261.1

A

1002-6630（2014）23-0139-05

10.7506/spkx1002-6630-201423028

2013-12-17

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31160310）；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項（GNSW-2013-16）；甘肅省青年科學(xué)基金項目（1208RJYA082）

侯曉瑞（1989—），男，碩士，研究方向為釀酒微生物。E-mail：houxiaorui1989@126.com

*通信作者：韓舜愈（1963—），男，教授，博士，研究方向為果蔬加工及葡萄酒釀造。E-mail：gsndhsy@163.com