李 輝，宋居易，劉 蕾，李平蘭

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

雙歧桿菌RH胞外多糖提取純化及體外抗凝血活性評價

李 輝，宋居易，劉 蕾，李平蘭*

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

為得到高純度雙歧桿菌RH胞外多糖，并探討其抗凝血功效，采用正交試驗優(yōu)化酶解提取工藝。優(yōu)化最佳酶解條件為：蛋白酶添加量2 g/L，中性蛋白酶與胰蛋白酶質量比例為1∶2，在pH 7.5的條件下酶解120 min。再經凝膠Sepharose CL-6B柱層析純化，得到胞外多糖純品。利用凝膠色譜結合多角度激光散射儀測得該胞外多糖分子質量為5.946×104D。進一步對其抗 凝血活性進行評價，不同質量濃度胞外多糖可以顯著延長活化部分凝血活酶時間和凝血酶時間，且具有劑量依賴效應。純化后胞外多糖純度可以達到97%以上，純多糖具有較好的體外抗凝血活性，主要參與內源凝血途徑。

雙歧桿菌；胞外多糖；提??；純化；抗凝血

微生物能夠產生多種類型的多糖，根據(jù)其與細胞壁的相對位置可以分為：莢膜多糖和胞外多糖[1-2]。胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是細菌在生長過程中分泌到細胞外的長鏈多糖，可以松散地附著在菌體表面或者完全釋放到環(huán)境中[3]。EPS屬于微生物的次級代謝產物，并不作為產生菌的能源物質。EPS具有生物防御功能，例如：抗干燥、抵抗原生動物的吞噬及噬菌體的浸染、拮抗?jié)B透脅迫等；此外，EPS還具有細胞識別、表面黏附、形成生物被膜促進菌體定植的功能[4-5]。乳酸菌EPS在水溶液里具有增稠和凝膠的特性，能夠改善發(fā)酵乳的質地，且乳酸菌具有公認的安全性，其產生的EPS可以替代工業(yè)增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑廣泛用于食品配方中[6]。20世紀40年代開發(fā)出的由腸膜明串珠菌產生的右旋糖酐是最早被開發(fā)利用的乳酸菌EPS，也是FDA批準的第一種可用于食品的微生物EPS[7]。眾多研究表明藻類多糖和真菌多糖具有抗凝血功能，對凝血酶原、凝血酶、白陶土部分凝血活酶進行測定，發(fā)現(xiàn)多糖在凝血過程中能顯著延長這些酶和酶原凝血時間，且與劑量呈正相關[8-11]。乳酸菌EPS是否同樣具有抗凝血活性有待進一步驗證。

雙歧桿菌RH菌株源自世界長壽之鄉(xiāng)——廣西巴馬瑤族自治縣長壽老人腸道，由實驗室分離并保存。菌株經生理化實驗和16S rDNA序列分析，鑒定為動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。該菌株能夠產生水溶性EPS，其基因組信息（GenBank登錄號：CP007755.1）也表明該菌株具有EPS生物合成特性[12]。前期研究表明該胞外多糖具有修復腸黏膜損傷、引起腸黏膜免疫調節(jié)、平衡腸道菌相等功能[13]，還具有體內體外的抗氧化活性[14]。因此，對EPS生物活性的研究具有重要意義。

本實驗采用酶解法和凝膠柱層析對雙歧桿菌RH EPS進行提取純化，得到純度較高的EPS，探究EPS體外抗凝血活性。研究結論豐富了現(xiàn)有雙歧桿菌EPS功能，并為新型保健品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

動物雙歧桿菌（Bif dobacterium animalis RH）：由本實驗室分離并保存。

兔血：采自新西蘭大耳白兔，SPF級成年雄性4 kg。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉120 g，蒸餾水1 L，充氮氣，105 ℃滅菌10 min。

1.2 試劑

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；中性蛋白酶 北京Solarbio公司；風味蛋白酶 江蘇銳陽生物技術公司；凝血酶原時間（prothrombintime，PT）測定試劑盒、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）測定試劑盒、凝血酶時間（thrombin time，TT）測定試劑盒 美國太平洋公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

DHL-A電腦恒流泵、BS-100A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；FD-1D冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Tskgel G4000 PWXL凝膠色譜柱 日本Tosoh公司；DAWN HELEOSⅡ多角度激光散射儀、Optilab rex示差檢測器 美國懷雅特技術公司；ACL TOP700自動血凝儀 美國貝克曼庫爾特公司。

1.4 方法

1.4.1 產糖發(fā)酵

菌種在脫脂乳培養(yǎng)基中活化3 代，取對數(shù)末期培養(yǎng)液接種至新鮮無菌脫脂乳培養(yǎng)基，接種量為107CFU/mL，于37 ℃厭氧發(fā)酵60 h。

1.4.2 酶解法除蛋白條件優(yōu)化

按照1.4.1節(jié)所述發(fā)酵液用4 層醫(yī)用紗布過濾，去除酸沉酪蛋白塊。過濾液100 ℃加熱5 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液進行酶解實驗。

1.4.2.1 不同蛋白酶酶解效率

根據(jù)每種蛋白酶最佳反應條件（表1）調節(jié)發(fā)酵上清液pH值（胃蛋白酶處理組選用發(fā)酵上清液pH值），添加2 mg/mL蛋白酶，最佳反應溫度下酶解90 min，沸水浴滅酶5 min，8 000 r/min離心10 min保留上清液；上清液用8 000～12 000 D透析袋，4 ℃透析48 h；添加3 倍體積無水乙醇，4 ℃沉淀過夜；沉淀用原體積蒸餾水復溶，檢測蛋白質含量，計算蛋白去除率。對照組除不添加蛋白酶外，其他操作與實驗組相同。三氯乙酸處理組，向發(fā)酵上清液中添加4%三氯乙酸，4 ℃沉淀2 h，8 000 r/min離心10 min保留上清液，透析、醇沉、復溶步驟同上。

式中：A0為對照組蛋白質含量/（mg/mL）；An為實驗組蛋白質含量/（mg/mL）。

表1 不同蛋白酶性質及酶活力Table1 Protease characteristics and enzyme activities

1.4.2.2 蛋白酶添加量對酶解效率的影響

調節(jié)發(fā)酵上清液pH值為7.5，分別添加1、2、4、6、8、10 mg/mL復合蛋白酶，中性蛋白酶與胰蛋白酶復合質量比（簡寫為m（中）∶m（胰），下同）為1∶1，45 ℃酶解90 min，沸水浴滅酶5 min，8 000 r/min離心10 min保留上清液，透析、醇沉、復溶步驟同上，檢測蛋白質含量，計算蛋白去除率。

1.4.2.3 酶解時間對酶解效率的影響

調節(jié)發(fā)酵上清液pH值為7.5，添加3 mg/mL中性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶，m（中）∶m（胰）=1∶1，45 ℃酶解60、90、120、150、180 min，沸水浴滅酶5 min，8 000 r/min離心10 min保留上清液，透析、醇沉、復溶步驟同上，檢測蛋白質含量，計算蛋白去除率。

1.4.2.4 酶解條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，將中性蛋白酶和胰蛋白酶復合使用。選取酶的添加量、酶解時間、pH值、酶的復合比例4 個因素，各取3 個水平，以蛋白去除率為指標，進行四因素三水平的正交試驗。

1.4.3 EPS分離提取

選取正交試驗最優(yōu)條件進行酶解，反應結束沸水浴滅酶5 min，冷卻后8 000 r/min離心10 min；上清液中加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃沉淀過夜，沉淀用少量蒸餾水復溶，8 000～12 000 D透析袋4 ℃透析48 h，真空冷凍干燥后獲得EPS粗品，避光干燥保存。

1.4.4 EPS純化

EPS用蒸餾水配制成5 mg/mL糖液，0.45 μm水系濾膜過濾后進行Sepharose CL-6B凝膠柱層析，上樣量為4 mL用0.05 mol/L NaCl恒速洗脫，洗脫速率為0.8 mL/min，每管8 mL部分收集，逐管檢測多糖含量（苯酚-硫酸法[15]測定A490nm），按多糖含量檢測值收集峰值管，8 000～12 000 D透析袋透析并冷凍干燥。

1.4.5 EPS鑒定

利用凝膠色譜結合多角度激光散射儀檢測EPS純度和分子質量。將EPS純品用0.1 mol/L NaNO3配制成2 mg/mL的溶液，進樣量200 μL。色譜條件：凝膠柱色譜柱Tskgel G4000 PWXL（78 mm×300 mm），DAWN HELEOSⅡ型多角度激光散射儀，Optilab rex型示差檢測器；柱溫25 ℃，流動相0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.5 mL/min。

1.4.6 EPS體外抗凝血活性評價

兔耳緣靜脈取血，按9∶1比例收集于含3.8 g/100 mL的枸櫞酸鈉抗凝劑管中。輕輕混勻，3 000 r/min離心15 min，取血清用于凝血活性實驗。

檢測PT、APTT、TT，向360 μL血清中添加高、中、低不同質量濃度EPS樣品各40 μL，使EPS終質量濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/mL，37 ℃孵育10 min，自動凝血儀檢測凝血時間，以血清樣品作對照[16-17]。

2 結果與分析

2.1 酶解法除蛋白單條件優(yōu)化

2.1.1 不同蛋白酶酶解效率

不同蛋白酶的酶切位點不同，針對不同底物，不同蛋白酶的酶解效率也存在差異。實驗選取6 種蛋白酶對雙歧桿菌發(fā)酵上清液進行酶解，不同蛋白酶的蛋白去除率見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解效率Fig.1 Hydrolysis efficiency of different proteases

三氯乙酸處理組蛋白質去除率最高。在不同的蛋白酶處理組中，堿性蛋白酶的酶解效率最高，但需要較高的pH值條件才能發(fā)揮活性。中性蛋白酶對酪蛋白的水解能力很強，胰蛋白酶對乳清蛋白的水解能力較強；脫脂乳培養(yǎng)基中酪蛋白和乳清蛋白的含量較高，文獻[18]報道將中性蛋白酶和胰蛋白酶復合使用能夠提高乳蛋白的水解效率；實驗驗證復合酶解效率大于兩種酶單一使用的效率。胃蛋白酶的酶活力很高，但是酶解效率較低，可能與酶解的pH值條件有關；產糖發(fā)酵上清液的pH值為4.53，為保證多糖穩(wěn)定性未將發(fā)酵上清液的pH值調至胃蛋白酶的最佳pH值，從而影響胃蛋白酶的活性。綜合酶解效率、反應最適溫度和pH值條件，選取中性蛋白酶和胰蛋白酶進行后續(xù)實驗。

2.1.2 酶添加量的影響

蛋白酶的添加量是影響酶解效率的重要因素。酶添加量不足，酶被底物飽和，酶解效率低；酶過量，則向溶液引入過多外源蛋白。將中性蛋白酶和胰蛋白酶按照1∶1的復合質量比例進行添加，不同酶添加量對酶解效率的影響見圖2。

圖2 不同蛋白酶添加量酶解效率Fig.2 Hydrolysis efficiency of different proteases at various addition amounts

由圖2可知，添加1 mg/mL蛋白酶，酶量不足，酶解效率偏低；添加2 mg/mL蛋白酶，酶解效率最高；添加量超過4 mg/mL，外源蛋白引入量加大，殘留蛋白含量增加。所以，蛋白酶添加量在2～4 mg/mL最佳。

2.1.3 酶解時間的影響

圖3 不同酶解時間酶解效率Fig.3 Hydrolysis efficiency of mixture of neutral protease and trypsin as a function of hydrolysis duration

按m（中）∶m（胰）=1∶1的比例添加3 mg/mL蛋白酶，分別酶解60、90、120、150、180 min，定期取樣滅活，透析后測定蛋白去除率。由圖3可知，延長酶解時間能夠提高蛋白去除率，但長時間的處理可能會影響多糖保留率及活性，應兼顧節(jié)能高效選取最佳作用時間。

2.1.4 正交試驗優(yōu)化

由單因素試驗結果可知，蛋白酶最佳添加量在2～4 mg/mL，延長酶解時間可以提高蛋白去除率。中性蛋白酶最佳pH值為7.0，胰蛋白酶最佳pH值為8.0。選擇酶的添加量、酶解時間、pH值、酶的復合比例，各取三水平，以蛋白去除率為指標進行正交試驗。

表2 酶解條件正交試驗優(yōu)化方案及結果Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of enzymatic hydrolysis conditions

根據(jù)表2直觀分析可知，各因素對蛋白質去除效果的影響由大到小依次為：酶的添加量＞m（中）∶m（胰）＞酶解時間＞pH值。根據(jù)各因素各水平均值確定酶解條件的最優(yōu)組合是A1B2C2D3，即按照m（中）∶m（胰）= 1∶2，添加量2 mg/mL，在pH 7.5的條件下酶解120 min。方差分析結果表明，因素A和D的P值＜0.05，即因素A和D對試驗結果有顯著影響。因此因素A和D為主要因素，B和C為次要因素，直觀分析結果可信。

因中性蛋白酶酶解最適溫度在40 ℃左右，胰蛋白酶酶解最適溫度為45 ℃，在單因素試驗中，酶解溫度40～50 ℃的范圍對酶解效果的影響很小，結合兩種酶的特性，確定酶解溫度為45 ℃。

2.2 凝膠柱層析純化

凝膠柱層析具有分子篩的作用，可根據(jù)分子質量不同或聚合度不同將混合物分離開。利用Sepharose CL-6B凝膠柱對EPS進行分離純化。EPS在Sepharose CL-6B凝膠柱上洗脫曲線如圖4所示，洗脫曲線呈現(xiàn)單一的對稱峰，峰型完整無拖尾現(xiàn)象，說明其為分子質量均一的單一組分。收集峰值管的洗脫液，透析后冷凍干燥即為EPS純品，用于后續(xù)純度和分子質量測定。

圖4 EPS Sepharose CL-6B凝膠柱層析洗脫曲線Fig.4 Gel permeation chromatography of EPS on Sepharose CL-6B column

2.3 EPS純度和分子質量

多糖的分子質量只代表鏈長的平均分布，利用不同方法測得多糖分子質量的結果也有較大差別。實驗利用凝膠色譜結合多角度激光散射儀（gel permeation chromatography multiangle laser light scattering，GPC/ MALLS）檢測多糖分子質量及分布。雙歧桿菌EPS凝膠色譜如圖5所示，第1個峰是大分子顆粒峰，但該峰只有激光值，沒有示差值，代表該物質濃度很低。第2個峰是多糖峰，且三氯乙酸純化的EPS經GPC/MALLS檢測峰型與此相同，激光值與示差值相繼出峰，示差峰與紫外峰同步，推測該EPS為糖蛋白。后續(xù)的小峰是雜質峰。

圖5 EPS GPC/MALLS凝膠色譜Fig.5 GPC/MALLS of EPS

表3 EPS純度及分子質量Table3 Molecular weight and purity of EPS

由表3可知，利用凝膠色譜結合多角度激光散射儀測得雙歧桿菌RH所產EPS的分子質量為5.946×104D，根據(jù)積峰值計算純度為97.045%。三氯乙酸純化EPS分子質量為5.607×104D，兩種去蛋白方法對EPS分子質量的影響較小，蛋白酶并未降解糖苷鍵。

Mw/Mn的值為多糖多分散系數(shù)（d），其大小是判斷樣品摩爾質量分布是否均勻的指標。樣品分子大小均一時，d值應比較小或接近1.0，表3顯示EPS的多分散系數(shù)為1.231，進一步說明雙歧桿菌EPS是寬分散的。

2.4 EPS體外抗凝血活性評價結果

凝血的過程包括：凝血酶原激活物的形成，凝血酶的形成，進一步促進纖維蛋白的形成[19]。根據(jù)凝血酶原激活物形成的途徑和參與因子，可將凝血分為內源性凝血和外源性凝血兩條途徑。內源性凝血，參與凝血的全部因子來源于血漿；外源性凝血，啟動源于組織因子。PT、APTT、TT作為評價血液凝固能力的指標，其中PT反映外源凝血系統(tǒng)狀況，APTT反映內源凝血系統(tǒng)狀況。

表4 不同質量濃度EPS體外抗凝血活性Table4 Anticoagulant activity of EPS with different concentrations

由表4可知，不同質量濃度EPS可以顯著延長APTT和TT，且具有劑量依賴效應，但對PT沒有延長作用。說明EPS具有一定的抗凝血活性，主要參與內源凝血途徑，并且進一步抑制凝血酶介導的纖維蛋白的形成來發(fā)揮抗凝血功效。

3 結 論

多糖提純的第一步是除蛋白，已報道的多糖除蛋白方法多為化學試劑法[20-21]。該方法不僅大量消耗有機試劑，多次、長時間處理可能會影響多糖的生物活性，并且殘留的化學試劑存在安全隱患，也不符合食品和保健品生產規(guī)范。本實驗嘗試利用酶解法降解蛋白，使之酶解為分子質量較小的多肽或氨基酸，最后通過乙醇沉淀和透析除去保留在溶液中的多肽和氨基酸，由此達到去除蛋白的目的。實驗結果表明，復合酶解法對乳蛋白的水解效果較好，可以替代有機試劑法作為EPS的純化方法。

肝素是臨床上廣泛應用的抗凝劑，但肝素多來源于動物組織和臟器，可能攜帶致敏原或致病微生物對患者造成危害[22]。此外，肝素還容易造成自發(fā)性出血和血小板減少癥，尋找更加安全有效的肝素替代物成為研究熱點。血漿中添加抗凝劑，若PT、TT大于正常范圍3 s，APTT大于正常范圍10 s，被認為可以延長凝血時間具有抗凝效果[23]。實驗證明雙歧桿菌RH EPS可顯著延長APTT和TT，具有一定的體外抗凝血活性，主要參與內源凝血途徑，這與肝素的作用機理相似。前期研究表明，該EPS含有糖醛酸[13]，D-葡萄糖醛酸又是構成肝素、硫酸軟骨素、透明質酸的成分，所以EPS具有抗凝血活性可能與其含有糖醛酸有關。雙歧桿菌RH EPS具有一定的體外抗凝血活性為進一步研究乳酸菌EPS的藥用價值提供了依據(jù)，但其具體的抗凝血機制有待進一步的體內實驗驗證。

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Extraction, Purification and in vitro Anticoagulant Activity of Exopolysaccharides from Bif dobacterium animalis RH

LI Hui, SONG Ju-yi, LIU Lei, LI Ping-lan*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Exopolysaccharides (EPS) are water-soluble extracellular polysaccharides with potential biological activities. In this study, we investigated the extraction, purification and anticoagulant activity of the EPS produced by Bif dobacteria animalis RH. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were found to be 120 min hydrolysis using a mixture of neutral protease with trypsin (1:2) at a total concentration of 2 g/L with an initial pH of 7.5 by orthogonal array design. The EPS was purified by Sepharose CL-6B column chromatography. The purity was 97.045% and the average molecular mass of the EPS was 5.946 × 104D as determined by GPC/MALLS. Furthermore, anticoagulant activity in vitro tests showed the EPS could significantly prolong activated partial thromboplastin time (APTT) and thrombin time (TT) in a dosedependent manner, rather than prothrombin time (PT). These results demonstrated that the EPS exhibited a significant anticoagulant activity in vitro.

Bif dobacterium; exopolysaccharides; extraction; purification; anticoagulation

Q939.99

A

1002-6630（2014）23-0129-05

10.7506/spkx1002-6630-201423026

2014-09-09

國家自然科學基金面上項目（31271827）；北京市自然科學基金項目（5122018）

李輝（1990—），女，碩士，研究方向為益生菌活性代謝產物。E-mail：feifeilihui@126.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn