李雅楠，邢邯英，郝玉賓

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。2012年，乳腺癌占美國女性新確診腫瘤的首位，占女性腫瘤相關(guān)病死率的第二位[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是涉及多因素的復(fù)雜過程，2005年，Iorio等[2]首次提出人乳腺癌組織中存在微小RNA(microRNAs，miRNAs)的表達改變。隨著對miRNAs研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNAs廣泛而穩(wěn)定地存在于血清、血漿、組織液及各類體液等細胞外液中，即循環(huán)miRNAs[3]。在疾病狀態(tài)如腫瘤、免疫性疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病等情況下，miRNAs的表達譜發(fā)生異常改變?，F(xiàn)就循環(huán)miRNAs與乳腺癌的相關(guān)研究進展做一綜述。

1 循環(huán)miRNAs

1.1 簡介 miRNAs是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)的長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈微小RNA，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。miRNAs主要通過與靶mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)特異性結(jié)合，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，發(fā)揮對基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。1993年，Lee等[4]在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了miRNAs家族的第一個成員lin-4，其能在翻譯水平抑制核蛋白表達，從而調(diào)控幼蟲的發(fā)育進程。隨后，科學(xué)家們通過隨機克隆和高通量測序、微陣列芯片、生物信息學(xué)預(yù)測等方法在動植物中發(fā)現(xiàn)了多種miRNAs。據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(http：//www.mirbase.org/)統(tǒng)計，至2012年8月已發(fā)現(xiàn)miRNAs 21 264個。據(jù)預(yù)測，50%以上的mRNA是miRNAs的靶點，并且每個miRNA可調(diào)控高達數(shù)百個靶基因[5]。2008年，Lawrie等[6]首次報道在B細胞淋巴瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-210及miR-21表達水平升高。之后大量實驗證實miRNAs可以廣泛而穩(wěn)定地存在于細胞外液，如血清、血漿、組織液及唾液、鼻腔分泌物、尿液等各種體液[7-9]，統(tǒng)稱為循環(huán)miRNAs。循環(huán)miRNAs對核糖核酸酶(RNase)、極端pH、溫度不敏感，不受反復(fù)凍融、長期保存、酸堿處理等影響[10]。良好的穩(wěn)定性及腫瘤相關(guān)性使得循環(huán)miRNAs成為腫瘤等疾病的非創(chuàng)傷性新型生物標(biāo)志物，是腫瘤診斷與防治的研究熱點。

1.2 來源 研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNAs或存在于外體(exosomes)、外來體樣囊泡(exosome-like vesicles)、微粒體(microparticles)和凋亡小體(apoptotic bodies)等微囊結(jié)構(gòu)中[11]，或包裹于高密度脂蛋白和RNA結(jié)合蛋白(如Ago2、核仁磷酸蛋白1)之中[12-13]。Turchinovich等[14]發(fā)現(xiàn)，血漿或細胞培養(yǎng)基中的miRNAs能完全通過0.22 μm的濾器，在110 000×g超速離心后miRNAs仍存在于上清液中，這提示循環(huán)miRNAs并非來自于微囊。免疫印跡分析顯示，超濾液中的細胞外miRNAs與RNA沉默復(fù)合體中的96 kD的Ago2相結(jié)合，血漿與培養(yǎng)基中的miRNAs在無清潔劑條件下能與抗Ago2抗體發(fā)生免疫共沉淀反應(yīng)。這首次證明細胞外miRNAs并非來自外體或微泡，而是與Ago2相關(guān)。故Turchinovich等推測循環(huán)miRNAs大部分來源于死細胞，由于Ago2和Ago2-miRNA復(fù)合體的高度穩(wěn)定性，使得miRNAs能穩(wěn)定存在于細胞外液，但并不排除有些循環(huán)miRNAs與外體相關(guān)的可能性。

2 循環(huán)miRNA與乳腺癌

目前，人們對循環(huán)miRNAs的來源和功能還不十分明確，但大量研究證明在某些病理過程中其表達譜發(fā)生改變(見表1)。自2005年Iorio等[2]首次發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中存在miRNAs改變，人們發(fā)現(xiàn)多種miRNAs以癌基因或抑癌基因的角色參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，大量實驗證實乳腺癌組織與正常組織相比，miRNAs表達譜不同(見表2)。有人提出是循環(huán)miRNAs表達譜而非腫瘤組織中的miRNAs表達譜反映乳腺癌的存在情況[55]。循環(huán)miRNAs涉及乳腺癌診斷、病理分級、藥物抵抗、轉(zhuǎn)移等多方面(見表3)。

2.1 循環(huán)miRNAs與乳腺癌的早期診斷 Cuk等[59]利用TaqMan低密度芯片檢測10例早期乳腺癌患者與10例健康人血漿miRNAs表達譜，篩選出7個miRNAs；并利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)在127例乳腺癌患者與80例健康人血漿中進行驗證，發(fā)現(xiàn)前者miR-148b、miR-409-3p、miR-801表達上調(diào)，可能有助于乳腺癌的早期診斷。Schrauder等[62]發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者全血中miR-202表達上調(diào)，miR-718表達下調(diào)。Si等[63]對比乳腺癌組織、原發(fā)性乳腺癌患者血清及健康對照者血清，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清miR-92a表達下調(diào)，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示血清miR-92b對乳腺癌具有潛在的預(yù)測價值。

有研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-145和miR-451聯(lián)合檢測乳腺癌的陽性預(yù)測值為88%，陰性預(yù)測值為92%；在乳腺癌早期血漿中已存在miR-145和miR-451改變，在乳腺導(dǎo)管原位癌中其陽性預(yù)測值高達96%[64]。乳腺癌患者血清miR-181a水平下調(diào)，受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示，在早期乳腺癌診斷中，miR-181a的敏感度為55.28%，而糖類抗原15-3(CA15-3)和癌胚抗原(CEA)的敏感度分別為8.13%和7.32%。相比之下，miR-181a用于乳腺癌早期診斷有更高的敏感度[65]。

2.2 循環(huán)miRNAs與乳腺癌的組織病理分級 Wang等[66]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者癌組織與血清中miR-21、miR-106a、miR-126、miR-155、miR-199a、miR-335的表達變化趨勢一致，血清miR-155在良性疾病乳腺組織表達水平升高1.7倍，Ⅱ級乳腺癌組織升高2.7倍，而Ⅲ級乳腺癌組織中升高4.0倍。血清miR-21、miR-106a、miR-155水平隨腫瘤惡性程度的增加也相應(yīng)升高，且在雌激素、孕激素陰性的患者中其表達也增高，證明循環(huán)miRNAs與乳腺癌組織病理分級及激素受體表達相關(guān)，可能成為乳腺癌診斷、組織病理分級和判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物[66]。

2.3 循環(huán)miRNAs與乳腺癌的藥物抵抗 癌癥的化療藥物抵抗常導(dǎo)致癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此迫切希望找到能夠預(yù)測輔助化療治療效果的分子標(biāo)志物來指導(dǎo)臨床工作。在浸潤性導(dǎo)管癌患者血清中，miR-125b表達水平上調(diào)，MCF-7、MDA-MB-231等乳腺癌細胞系中，其過表達能顯著抑制5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細胞毒作用，敲低之后細胞毒作用增強。這提示循環(huán)miR-125b與乳腺癌化療抵抗相關(guān)[67]。

Schwarzenbach等[60]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清miR-214表達上調(diào)，術(shù)后則顯著下降，且與局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Razis等[68]發(fā)現(xiàn)磷酸酶基因(PTEN)的缺失與曲妥珠單抗治療人表皮生長因子受體2(HER2)陽性乳腺癌患者的低生存率有關(guān)，而PTEN是miR-214的重要靶點，是否miR-214的上調(diào)導(dǎo)致靶基因PTEN降低或缺失，從而間接導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥，尚需實驗證明。

2.4 循環(huán)miRNAs與乳腺癌轉(zhuǎn)移 Chen等[69]發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血漿中miR-10b和miR-373水平升高，兩者聯(lián)合檢測診斷乳腺癌的敏感度為72.0%，特異度達94.3%，是檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的潛在標(biāo)志物。Zhao等[70]檢測到血清miR-10b過表達與原發(fā)乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，敏感度為64.8%，特異度為69.5%，且其升高水平與臨床階段的惡性程度相一致，提示其可能為新的治療靶點。

Sun等[58]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清miR-155的表達水平是正常人的2.94倍，且與乳腺組織中miR-155的表達變化一致；術(shù)后血清miR-155表達水平明顯下降，這提示其可能來源于腫瘤組織。有趣的是，化療之后其水平也降至基礎(chǔ)水平。研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移時，miR-155水平顯著升高，當(dāng)轉(zhuǎn)移灶控制以后，miR-155水平又回到術(shù)前水平，這提示miR-155可能是腫瘤細胞的生長刺激因子。

Wu等[71]研究了26例乳腺癌分級在Ⅱ～Ⅲ級的患者血清，其中包括8例2年后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病例，發(fā)現(xiàn)miR-122在復(fù)發(fā)病例中的表達顯著升高，其預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移的敏感度為88%，特異度為78%。

3 循環(huán)miRNAs檢測

3.1 檢測方法 循環(huán)miRNAs的檢測方法主要有高通量測序法、miRNAs微陣列芯片和RT-qPCR法。高通量測序法能在序列未知情況下研究miRNAs表達譜變化，可發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNAs分子，但檢測費用昂貴，不適合臨床檢測。miRNAs微陣列芯片能進行miRNAs表達譜分析和多種miRNAs同時檢測，鑒于miRNAs微陣列芯片價格較貴，且結(jié)果不穩(wěn)定，只能用于miRNAs初篩。RT-qPCR是最常用的檢測手段，能對miRNAs定性或定量研究，可作為miRNAs微陣列芯片檢測結(jié)果的確證實驗，有較高的敏感度和特異度，但無法發(fā)現(xiàn)新的miRNAs分子，且研究內(nèi)容不如miRNAs微陣列芯片技術(shù)全面[3]。

近幾年，很多新型循環(huán)miRNAs檢測技術(shù)出現(xiàn)。Broyles等[72]設(shè)計用熒光基團/淬滅基團標(biāo)記的寡核苷酸探針同時檢測血清多種miRNAs。目的基因不存在時，熒光基團與淬滅基團互補結(jié)合，導(dǎo)致以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的熒光信號的淬滅；當(dāng)存在目的基因時，其與淬滅探針雜交，隨著淬滅探針被目的基因遮蔽超過福斯特半徑，熒光強度逐漸增強。此方法的優(yōu)點在于可直接檢測而無需進行血清RNA提取，可用于定量分析，檢測限低，能檢測液相DNA或RNA靶基因。非標(biāo)記電化學(xué)基因傳感器技術(shù)可直接檢測miRNAs，無需進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和標(biāo)記反應(yīng)，可用于血清等生物樣品miRNAs常規(guī)檢測[73]?；讦寥苎氐募{米孔傳感器，利用可編程序的寡核苷酸探針，產(chǎn)生靶點特異性信號，可定量亞皮克水平的腫瘤相關(guān)miRNAs，可辨別miRNAs家族成員之間單核苷酸差異，無需標(biāo)記和擴增[74]。

表1 疾病與循環(huán)miRNAs表達譜變化

注：PBMCs=外周血單個核細胞，CA19-9=糖類抗原19-9，ALT=丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶

表2 乳腺癌組織miRNAs表達譜的改變及作用

注：NRF2=核因子紅系2相關(guān)因子，F(xiàn)FPE=甲醛固定石蠟包埋，HOXA10=同源盒基因A10，MIM=轉(zhuǎn)移消失蛋白，RhoA=大鼠肉瘤同系物家族成員A，TGF-β=轉(zhuǎn)化生長因子β，VHL=希佩爾林道抑癌基因，KLF4=Kruppel樣因子4，PTGS2=前列腺素合酶2，PKCε=蛋白激酶Cε，BCL2=B細胞淋巴瘤/白血病-2，NF-κB=核因子κB，ERK=胞外信號調(diào)節(jié)激酶，F(xiàn)AK=局部黏著斑激酶

表3 循環(huán)miRNAs在乳腺癌診斷、病理分級、藥物抵抗、轉(zhuǎn)移等中的作用

注：RT-qPCR=實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，TLDA=TaqMan低密度芯片，CEA=癌胚抗原，CA15-3=糖類抗原15-3，microarray=微陣列芯片

3.2 循環(huán)miRNAs檢測面臨的問題 目前，找到像U6一樣恒定表達的內(nèi)源性miRNAs作為內(nèi)參，仍是臨床檢測循環(huán)miRNAs標(biāo)志物和實驗室之間進行結(jié)果對比的主要障礙。Hu等[75]采用Solexa測序和TaqMan低密度芯片兩種技術(shù)在10例患者血清中系統(tǒng)篩查miRNAs，并用RT-qPCR在50例血清中進行驗證，通過兩級病例對照分析篩選出2個候選miRNAs，即miR-191和miR-484，敏感度和特異度均為91.9%。還可以通過以下兩種方法來減少實驗變異：使用相同體積的血清；使用人工合成的非內(nèi)源性miRNAs，如在提取RNA開始即加入秀麗隱桿線蟲的miRNAs。

盡管循環(huán)miRNAs能用于預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)移，但其檢測并未考慮到以下兩點：第一，并不是腫瘤組織中的所有細胞都具有轉(zhuǎn)移能力，具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細胞在遺傳組成上也可能不同；第二，在發(fā)生轉(zhuǎn)移時，殘留的或復(fù)發(fā)的腫瘤細胞的遺傳特征與原發(fā)腫瘤可能不同，因為腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶可能發(fā)生在很多年后，且已接受過多種抗腫瘤療法。這些因素都可能導(dǎo)致原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移灶之間的基因和表觀遺傳組成的差異[76]。

4 展望與小結(jié)

傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，如CEA、CA15-3對乳腺癌的預(yù)測有診斷價值，但血液蛋白質(zhì)組成復(fù)雜、水平低、穩(wěn)定性相對差、敏感度低等缺點，在檢測早期癌癥方面意義不大[77]。循環(huán)miRNAs具有高度保守性、高度穩(wěn)定性、疾病特異性、無創(chuàng)或微創(chuàng)、檢測敏感度高等特點，彌補了蛋白質(zhì)標(biāo)志物的不足，有替代傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物成為新型生物標(biāo)志物的潛能。目前，循環(huán)miRNAs研究結(jié)果有一定的局限性：第一，研究樣本量小，不能兼顧到所有乳腺癌類型，得不出確切的結(jié)果；第二，研究發(fā)現(xiàn)有些循環(huán)miRNAs在手術(shù)前后并未明顯變化，可能是由于取樣時間與手術(shù)的時間間隔較短；第三，大部分研究為橫向觀察，缺乏對疾病復(fù)發(fā)、無病生存期等預(yù)后效果的長期隨訪，缺乏對這期間循環(huán)miRNAs表達變化的研究。因此，對大規(guī)模不同類型的乳腺癌樣本和術(shù)后不同時間點的樣本中循環(huán)miRNAs的觀測來證實前人得出的結(jié)果，是今后研究的重點。

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