王俊文，李 俊，蔡 倫，張 濤，王和平，王 雷，陳 文，韓 林

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控和基因表達(dá)，是治療多種腫瘤性疾病如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)[1-2]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為3類：第Ⅰ類與酵母RPD3同源，包括HDAC1-3及HDAC8；第Ⅱ類與酵母HAD1同源，包括HDAC4-7和HDAC9-11；第Ⅲ類與酵母SIR2同源，命名為SIRT1-7。目前發(fā)現(xiàn)Ⅰ類HDACs與腫瘤細(xì)胞增殖、分化關(guān)系密切，其在多種腫瘤組織中過度表達(dá)，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌[2]，但有關(guān)Ⅰ類HDACs在星形細(xì)胞瘤中表達(dá)的研究報(bào)道較少，其表達(dá)與患者預(yù)后間的確切關(guān)系尚未明確[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)HDAC3可同時(shí)在胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，其在胞核和胞質(zhì)內(nèi)的移位與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探討HDAC3在星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 選擇華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1996年1月—2008年1月收治的283例原發(fā)性星形細(xì)胞瘤患者和52例復(fù)發(fā)患者，均經(jīng)病理檢查證實(shí)，WHO分級(jí)為Ⅱ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅱ級(jí)59例，Ⅲ級(jí)26例，Ⅳ級(jí)250例；收集其手術(shù)切除標(biāo)本，提取典型病變區(qū)域制作成組織芯片(tissue micro-array，TMA)。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 采用胰酶消化新鮮腫瘤組織，將消化獲得的腫瘤細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在含10%胎牛血清培養(yǎng)基(Gibco公司)上培養(yǎng)并傳代。

1.4 熒光定量PCR 提取培養(yǎng)細(xì)胞RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度并定量；取2 μg RNA樣本在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再取反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物1 μl在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HDAC3上、下游引物序列分別為5′-TCTGGGCTGTGATCGATTG- 3′和5′-CTTGACATATTCAACGCATTCC- 3′；以管家基因PITPNB為內(nèi)參基因，其上、下游引物序列分別為5′- CGAGACTCAGAAAGAACTAGAAACAA-3′和5′- TGACCCTACAGGGGACTCAT-3′。所有引物由Roche公司合成。HDAC3在腫瘤干細(xì)胞、膠質(zhì)瘤貼壁細(xì)胞和星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平采用相對(duì)表達(dá)量表示，即HDAC3與PITPNB的比值。

1.5 免疫組化染色 在對(duì)TMA進(jìn)行染色之前，采用同型參照抗體在標(biāo)本上進(jìn)行同濃度一抗特異性檢測(cè)，參照抗體購(gòu)自Acris公司，一抗〔單克隆兔抗人HDAC3(1∶200)〕購(gòu)自Abcam公司；抗原修復(fù)，一抗、二抗孵育及ABC試劑盒顯色均按照常規(guī)操作流程進(jìn)行，ABC試劑盒購(gòu)自Vector Laboratories公司；免疫熒光雙染抗體單克隆鼠抗人CD31(1∶100)、單克隆鼠抗人Ki-67(1∶50)、單克隆鼠抗人CD68(1∶100)均購(gòu)自BD Pharmingen公司，預(yù)稀釋單克隆鼠抗人GFAP購(gòu)自Progen公司，ALEXA488抗鼠和ALEXA555抗兔二抗(1∶500)均購(gòu)自Invitrogen公司。

1.6 TMA染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由2位高年資研究員分別進(jìn)行TMA染色結(jié)果判斷，主要是根據(jù)每份標(biāo)本中陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行半定量分級(jí)；2位研究員判斷結(jié)果差異較大時(shí)則進(jìn)行機(jī)械計(jì)數(shù)評(píng)估。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 患者總生存期為診斷成立之日到患者死亡之日，隨訪截止日期為2010-11-30，隨訪時(shí)間為2.6～15.4年，平均為(10.7±4.3)年，其中11例患者中途失訪，以最后一次隨訪時(shí)間為研究終點(diǎn)；復(fù)發(fā)患者、臨床資料或隨訪資料不全患者均不納入生存周期分析。采用Environment R,Version 2.4.1統(tǒng)計(jì)軟件(http://www.r-project.org)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪制Kaplan-Meier曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)分析HDAC3表達(dá)與患者生存率間的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDAC3表達(dá)水平 HDAC3在腫瘤干細(xì)胞NCH421k和NCH441中的平均相對(duì)表達(dá)量為1.14和0.95，在膠質(zhì)瘤貼壁細(xì)胞中為2.04，在星形細(xì)胞瘤中為1.06。

2.2 免疫組化染色結(jié)果 HDAC3在瘤細(xì)胞胞核和胞質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)(見圖1～2)。HDAC3胞核總陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%(56/335)，其中WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)者為13.6%(34/250)，WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)者為0，WHO分級(jí)Ⅱ級(jí)者為37.3%(22/59)；HDAC3胞質(zhì)總陽(yáng)性表達(dá)率為49.3%(165/335)，其中WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)者為42.0%(105/250)，WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)者為65.4%(17/26)，WHO分級(jí)Ⅱ級(jí)者為72.9%(43/59)。

圖1 HDAC3在WHO分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)(免疫組化染色，×20，內(nèi)插×40)

Figure1 Expression of HDAC3 in astrocytic tumors with WHO stageⅡ to Ⅳ

注：A為CD31染色對(duì)比，B為CD68染色對(duì)比，C為GFAP染色對(duì)比

圖2 HDAC3在星形膠質(zhì)瘤、內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)(免疫雙熒光染色，×40)

Figure2 Expression of HDAC3 in astrocytic tumors,endothelial cells and microglia cells

2.3 HDAC3在復(fù)發(fā)患者中的表達(dá) 52例復(fù)發(fā)患者中23例兩次TMA保存完整，可進(jìn)行對(duì)比觀察，其中5例WHO分級(jí)惡化，18例WHO分級(jí)無惡化。5例WHO分級(jí)惡化患者中，HDAC3胞核染色強(qiáng)度減弱2例，穩(wěn)定2例，增強(qiáng)1例；胞質(zhì)染色強(qiáng)度穩(wěn)定4例，增強(qiáng)1例。18例WHO分級(jí)無惡化患者中，HDAC3胞核染色強(qiáng)度減弱2例，穩(wěn)定13例，增強(qiáng)3例；胞質(zhì)染色強(qiáng)度減弱4例，穩(wěn)定9例，增強(qiáng)5例。

2.4 HDAC3表達(dá)與患者生存率的關(guān)系 HDAC3胞核陽(yáng)性表達(dá)率與患者整體生存率呈正相關(guān)(r=0.148，P=0.007，見圖3A)，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)患者生存率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.503，P=0.037，見圖3B)；HDAC3胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與患者整體生存率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.140，P=0.014，見圖4A)，陽(yáng)性表達(dá)率與WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)患者生存率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.544，P=0.013，見圖4B)。

注：A為WHO分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)患者，n=283；B為WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)患者，n=250

圖3 HDAC3在胞核中的表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者生存率間的關(guān)系(Kaplan-Meier曲線)

Figure3 Correlation between nuclear expression of HDAC3 and survival rate of patients with astrocytic tumors

注：A為WHO分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)患者，n=283；B為WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)患者，n=250

圖4 HDAC3在胞質(zhì)中的表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者生存率間的關(guān)系(Kaplan-Meier曲線)

Figure4 Correlation between cytoplasmic expression of HDAC3 and survival rate of patients with astrocytic tumors

3 討論

HDAC3屬I類HDACs，其克隆序列與HDAC1及HDAC2類似[6]。HDAC3與HDAC1在DNA序列上有50%相同，在蛋白質(zhì)序列上有53%相同；HDAC3與HDAC2在DNA序列上有51%相同，在蛋白質(zhì)序列上有52%相同。但與HDAC1和HDAC2不同的是，HDAC3缺少前兩者共有的氨基端及羧基端結(jié)構(gòu)，可在胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)并具有免疫活性[7]，而前兩者只局限在胞核內(nèi)表達(dá)。此外，HDAC3還具有核定位信號(hào)(NES)和核輸出信號(hào)(NLS)，其共同決定了HDAC3在細(xì)胞內(nèi)的分布[8]。Bhaskara等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC3與鼠胚胎干細(xì)胞的分化相關(guān)，HDAC3缺失可導(dǎo)致第9.5天時(shí)胚胎死亡，原因?yàn)榧?xì)胞分化缺陷；HDAC3還可以延長(zhǎng)細(xì)胞周期，修復(fù)DNA損傷，敲除HDAC3基因后胚胎纖維原細(xì)胞凋亡增加。Escaffit等[10]研究發(fā)現(xiàn)，滅活雞或哺乳動(dòng)物體內(nèi)HDAC3過度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Liby等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC3在正常膠質(zhì)細(xì)胞及非惡性增生角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)呈一致的胞核/胞質(zhì)弱染色，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)則呈現(xiàn)明顯的強(qiáng)染色，且主要為胞質(zhì)強(qiáng)染色。

本研究結(jié)果顯示，HDAC3在腫瘤干細(xì)胞NCH421k和NCH441中的平均相對(duì)表達(dá)量為1.14和0.95，在膠質(zhì)瘤貼壁細(xì)胞中為2.04，在星形細(xì)胞瘤中為1.06，介于腫瘤干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤貼壁細(xì)胞之間；在胞核和胞質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá)，其中胞核總陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%，胞質(zhì)總陽(yáng)性表達(dá)率為49.3%，在復(fù)發(fā)患者中，HDAC3表達(dá)基本穩(wěn)定或減弱；通過繪制Kaplan-Meier曲線發(fā)現(xiàn)，胞核或胞質(zhì)HDAC3的表達(dá)與患者WHO分級(jí)相關(guān)。由于HDAC3自身具備的特點(diǎn)，其可以在胞核及胞質(zhì)內(nèi)同時(shí)存在或發(fā)生移位，Liby等[11]研究也發(fā)現(xiàn)HDAC3在非惡性膠質(zhì)細(xì)胞核表達(dá)。既往研究顯示，HDAC3在胞核的表達(dá)與胃癌、腎癌、結(jié)直腸癌患者生存周期無關(guān)，本研究結(jié)果與之不一致，提示HDAC3在星形細(xì)胞瘤中的作用與其在其他腫瘤中的作用不同，HDAC3在胞核中的高表達(dá)預(yù)示著星形細(xì)胞瘤患者預(yù)后更好。

通常情況下，胞質(zhì)內(nèi)HDAC3與IκBα/NF-κB構(gòu)成靜默復(fù)合體，可有效抑制NF-κB和HDAC3的功能，而一旦被激活，IκBα將發(fā)生磷酸化并被蛋白酶體降解，HDAC3-NF-κB/IκBα靜默復(fù)合體解體，HDAC3和NF-κB便可轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，可結(jié)合于NF-κB增強(qiáng)子區(qū)并募集組蛋白乙酰化酶p300/PCAF乙?；M蛋白疏松染色體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而啟動(dòng)一系列靶基因轉(zhuǎn)錄過程，如NF-κB負(fù)反饋抑制蛋白IκBα轉(zhuǎn)錄、新合成的IκBα結(jié)合NF-κB并中止其促轉(zhuǎn)錄等。NF-κB募集的組蛋白乙?；竝300/PCAF在乙?；M蛋白的同時(shí)也乙?；薔F-κB亞單位RelA(p65)，以穩(wěn)固RelA(p65)與DNA的結(jié)合，削弱RelA(p65)與IκBα的結(jié)合，從而保證下游基因的轉(zhuǎn)錄；而HDAC3則能夠使RelA(p65)去乙酰化，促進(jìn)其解離DNA并中止相關(guān)轉(zhuǎn)錄過程。有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在很多腫瘤中過度激活，對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)失控，過度激活的NF-κB可增強(qiáng)促瘤生長(zhǎng)相關(guān)蛋白如Bcl-2、Sox2等的表達(dá)，減少抑制瘤生長(zhǎng)相關(guān)蛋白如Bax、PPARγ等的表達(dá)。

Escaffit等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC3具有抗細(xì)胞凋亡的作用，穩(wěn)定的核內(nèi)HDAC3表達(dá)不僅可抑制半胱氨酸介導(dǎo)的聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)的降解，還能抑制NKG2D自然殺傷細(xì)胞及配體ULBPs在上皮細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)，而這兩者可引起自然殺傷細(xì)胞及T細(xì)胞介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫識(shí)別及消除[12]。在核內(nèi)，HDAC3可以與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb蛋白)及過氧化酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)結(jié)合形成三元復(fù)合體，這種三元復(fù)合體可以抑制PPARγ的活性，并在激活的分化期內(nèi)保持細(xì)胞穩(wěn)定。當(dāng)感應(yīng)到凋亡信號(hào)時(shí)，胞核內(nèi)的HDAC3被游離并轉(zhuǎn)移入胞質(zhì)，從而不再造成凋亡啟動(dòng)子上的組蛋白去乙酰化，發(fā)揮抗凋亡作用。除了導(dǎo)致組蛋白去乙?；?，HDAC3亦可與其他蛋白直接作用[13]，可通過導(dǎo)致Re1A去乙?；苯右种颇承┺D(zhuǎn)錄因子如GATA-2、YY1及TFII-I等的表達(dá)[14-15]。

綜上所述，HDAC3在胞核和胞質(zhì)的雙重表達(dá)及移位對(duì)星形細(xì)胞瘤的生物學(xué)特質(zhì)具有重要的調(diào)節(jié)作用，有效調(diào)控HDAC3在胞核的表達(dá)對(duì)抑制星形細(xì)胞瘤進(jìn)展具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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