高炳玉，劉 玉，夏立平，鄭武平，蘇潔之，陳峙霖

TYMS(thymidylate synthase)基因定位于第18號染色體上(18p11.32)，其編碼的胸苷酸合酶(TS)是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是腫瘤生長的重要因子[1]。TS作為催化胸苷酸合成的關鍵酶，在細胞的生長和DNA復制過程中具有關鍵作用，是抗腫瘤的重要靶點之一。部分臨床研究表明，在胃癌、原發(fā)性直腸癌等癌癥中，TS表達水平與患者的化療預后呈負相關，因此TS表達情況有望成為評估腫瘤預后的一個重要指標。然而目前本文創(chuàng)新點——培美曲塞可作為治療局部或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌(NSCLC)的二線治療藥物，以往部分研究表明胸苷酸合酶(TS)mRNA表達水平與培美曲塞療效有一定相關性，但對培美曲塞單藥療效與TS mRNA表達水平相關性研究較少。本研究觀察了培美曲塞單藥治療海南黎族晚期肺腺癌的療效及其與TS mRNA表達水平的相關性，并比較了患者癌組織與癌旁組織的TS mRNA表達水平差異。

對肺腺癌癌組織和癌旁組織中TS表達差異以及與藥物敏感性和生存預后的相關性研究較少，尤其是對于黎族人群的研究更是空白。本研究通過觀察海南黎族肺腺癌患者癌組織和癌旁組織中TS mRNA表達水平及探討其與培美曲塞化療后預后的相關性，以期為黎族肺腺癌患者的化療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年6月—2009年4月在我院手術治療的病理診斷為晚期肺腺癌患者52例，TNM分期T4期，其中男42例，女10例；年齡為44～80歲，中位年齡為62歲?；颊咝g后均進行化療，化療前血常規(guī)、肝腎功能均正常，心電圖無明顯異常。患者對化療方案知情同意，給予培美曲塞二鈉單藥的化療方案：注射用培美曲塞二鈉500 mg/m2，靜脈滴注，第1天；同時口服地塞米松、葉酸和肌肉注射維生素B12，21 d為1個治療周期，4個治療周期為藥物研究治療周期。

1.2 方法 選取患者手術切除的癌組織和癌旁組織，置于液氮中保存?zhèn)溆?。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和相對定量的方法檢測癌組織和癌旁組織中TS mRNA表達水平。然后隨訪觀察患者的療效及安全性，隨訪時間截至2012-03-30。

1.2.1 TS mRNA表達水平檢測

1.2.1.1 總RNA提取 采用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)分別提取癌組織和癌旁組織總RNA，采用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific公司)檢測RNA提取質(zhì)量和濃度。

1.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 采用cDNA Synthesis Kit(TAKARA公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μl，dNTP 混合物1 μl，RNA酶抑制劑1 μl，隨機引物2 μl，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μl，提取總RNA 2 μg，無RNA酶水補足體積至20 μl。反應條件為：95 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，72 ℃ 5 min。cDNA模板保存于-20 ℃。

1.2.1.3 引物設計和擴增效率檢測 GAPDH上游引物：5′-CTTGTCATCAATGGAAATCC-3′，下游引物：5′-GCAGAGATGATGACCCTTTTG-3′，擴增產(chǎn)物長度170 bp；TS上游引物：5′-AAATTCAGCTTCAGCGAGAAC-3′，下游引物：5′-GACTGACAATATCCTTCGAGCTC-3′，擴增產(chǎn)物長度182 bp。引物由上海英俊生物技術有限公司合成，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物特異性。采用染料法(SYBR Green)分別擴增TS和內(nèi)參基因GAPDH，進行相對定量(ΔΔCt法)。取反轉(zhuǎn)錄好的模板cDNA，分別進行2、4、8、16倍稀釋，制作標準曲線。定量PCR體系為：SYBR定量試劑10 μl，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，DNA模板1.5 μl，滅菌蒸餾水補足至20 μl。反應條件為：98 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，收集熒光，40個循環(huán)。

1.2.2 預后情況分析 從患者手術日截至2012-03-30，記錄患者無復發(fā)生存期(RFS)和總生存期(OS)。RFS為患者根治性手術到復發(fā)或末次隨訪的時間；OS為患者根治性手術到死亡或末次隨訪的時間。

2 結(jié)果

2.1 擴增效率標準曲線 將cDNA模板進行倍數(shù)稀釋后，制作標準曲線(見圖1、圖2)。TS與GAPDH基因標準曲線的斜率(M值)分別為-3.552和-3.502，兩者的差值<0.1，表明兩個基因的擴增效率非常接近，故本體系可用于TS mRNA表達水平相對定量檢測。

圖1 TS基因擴增效率標準曲線

圖2 GAPDH基因擴增效率標準曲線

2.2 TS mRNA表達水平檢測結(jié)果 52例肺腺癌患者組織標本中，35例(67.3%)癌組織TS mRNA表達水平低于其癌旁組織，17例(32.7%)癌組織TS mRNA表達水平高于其癌旁組織。癌組織與癌旁組織中TS mRNA表達水平〔cut-off值分別為(4.46±1.89)和(5.77±1.29)〕間差異有統(tǒng)計學意義(t=0.53，P<0.05)。

52例肺腺癌患者癌組織中TS mRNA表達水平相差67倍，以cut-off均值為界，TS mRNA高表達患者29例(55.8%)，低表達患者23例(44.2%)。癌旁組織中TS基因mRNA表達水平相差54倍，以cut-off均值為界，TS基因mRNA高表達患者32例(61.5%)，低表達患者20例(38.5%)。

2.3 TS mRNA表達水平與預后的關系 隨訪結(jié)束時，52例肺腺癌患者中位RFS為14.67個月，中位OS為19.14個月。癌組織TS mRNA高表達組中位RFS為11.50個月，中位OS為18.21個月；低表達組中位RFS為18.00個月，中位OS為23.72個月。

癌組織TS mRNA低表達組患者的無復發(fā)生存率和總生存率分別為61.0%和56.5%，與癌組織TS mRNA高表達組的39.0%和43.5%比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為7.63和4.35；P<0.05，見圖3、圖4)。

圖3 TS mRNA低表達者與高表達者無復發(fā)生存曲線

Figure3 The relapse-free survival curves of patients with low TS mRNA expression and patients with high TS mRNA expression

圖4 TS mRNA低表達者與高表達者總生存曲線

Figure4 The survival curves of patients with low TS mRNA expression and patients with high TS mRNA expression

3 討論

人類TS是由兩個相同亞單位組成的二聚體蛋白，其基因定位于第18號染色體上(18p11.32)。其是DNA生物合成的關鍵酶，TS的表達與腫瘤的惡性生物學行為密切相關[2]。培美曲塞是臨床常用的治療肺癌的藥物之一，用于二線治療的前期臨床研究顯示具有較好的緩解率和生存優(yōu)勢，特別是在非鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)的分析中體現(xiàn)了培美曲塞的治療優(yōu)勢[3]。

以往研究顯示，TS mRNA或蛋白的表達水平與腫瘤患者化療藥物的敏感性及生存預后呈負相關[4-9]，但是對癌組織和癌旁組織TS表達差異以及與藥物敏感性和生存預后的種族差異性研究較少。在最近的一項研究中，Yamane等[4]通過對55例結(jié)直腸癌患者的TS mRNA表達水平研究發(fā)現(xiàn)，低TS表達水平的患者，其中位生存時間大于高TS表達患者(3.77年與2.39年)，提示TS mRNA表達水平可以作為患者的一個預后因子。Nakagawa等[5]通過RT-PCR和免疫組化的方法檢測了46例結(jié)直腸癌患者中TS mRNA表達水平和蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TS蛋白表達水平與mRNA表達水平具有一定的相關性，但是患者OS與TS mRNA表達水平無相關性，而TS蛋白表達陰性的患者OS明顯高于陽性表達患者，提示TS蛋白表達水平可以作為患者的一個預后判定因子。

患者個體和種族的差異常會影響其對腫瘤的易患性以及癌癥患者對化療藥物的敏感性甚至預后，以往研究中未見種族的差異是否會影響TS mRNA表達水平作為預后的指導價值。本研究選擇海南黎族肺腺癌患者作為研究對象，探討了TS mRNA表達水平作為判定海南黎族肺腺癌患者藥物敏感性和預后指標的臨床價值。初步的研究結(jié)果顯示，癌組織TS mRNA低表達組患者的無復發(fā)生存率和總生存率均高于高表達組，提示TS mRNA低表達的患者更能從培美曲塞為主的輔助化療方案中受益，可用于其預后預測。因此，早期檢測患者癌組織內(nèi)的TS mRNA表達水平，可能有助于個體化選擇化療藥物。但是由于本研究病例數(shù)較少、隨訪時間較短，因此要全面理解TS mRNA表達水平對患者接受培美曲塞藥物輔助化療肺腺癌患者預后的影響，仍需進一步擴大樣本量，延長隨訪時間，同時設立未化療或其他方案化療的對照組。

1 Ofi T，Takahashi E，Ayuzawa D，et al.Regional assignment of the human thymidylate synthasc(TS) gene to chromosome band 18pl1.32 by nonisetopic in situ by hybridization[J].Hum Genet，1990，85(6)：576-580.

2 Ancey J，Shepherd RA，Gralla RJ，et al.Quality of life assessment of second-line docetaxel versus best supportive care in patients with non-small-cell lung cancer previously treated with platinum.Based chemotherapy：restllts of a prospective，randomized phase III trial[J].Lung Cancer，2004，43：183-194.

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4 Yamane T，Seshimo A，Kameoka S.Analysis of the mRNA expression levels of thymidylate synthase(TS)，dihydropyrimidine dehydrogenase(DPD) and orotate phosphoribosyl transferase(OPRT) in liver metastases from colorectal cancer[J].Hepato Gastroen Terology，2013，60(122)：291-295.

5 Nakagawa T，Shimada M，Kurita N，et al.Thymidylate synthase(TS) protein expression as a prognostic factor in advanced colorectal cancer：a comparison with TS mRNA expression[J].Hepatogastroenterology，2012，59(116)：1059-1062.

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9 Smit E，Mattson K，von Pawel J，et al.ALIMTA(pemetrexed disodium)as second-line treatment of non-small cell lung cancer：a phase Ⅱ study[J].Ann Oncol，2003，14(3)：455-460.