吳建珩，李曉輝，單 嶠，李培棟

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性增長包括細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解等諸多過程，所涉及的分子機(jī)制十分復(fù)雜。星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1 (astrocyte elevated gene-1，AEG-1)是2002年用改良的快速減數(shù)雜交(rapid subtraction hybridization，RaSH)法首次發(fā)現(xiàn)1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染后星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增高的新基因，該區(qū)域也是與人類腦膠質(zhì)瘤發(fā)生高度相關(guān)的地帶[1]。近些年研究表明，AEG-1與胃癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，能夠促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是ECM降解過程中最重要的一類酶，其中MMP-9與腦膠質(zhì)瘤的侵襲性生長密切相關(guān)。目前，國內(nèi)外對(duì)AEG-1和MMP-9在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用的研究報(bào)道較少。本研究通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Western blotting檢測AEG-1與MMP-9在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，分析兩者的相關(guān)性，并探討其與腦膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年5月—2012年6月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院住院的具有明確病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本72例為腦膠質(zhì)瘤組，患者術(shù)前均未行放化療。按照《2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織學(xué)分類》[3]標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，其中低級(jí)別組(Ⅰ～Ⅱ級(jí))32例，男17例、女15例，年齡31～85歲，平均(58.7±5.9)歲；高級(jí)別組(Ⅲ～Ⅳ級(jí))40例，男22例、女18例，年齡33～87歲，平均(60.2±6.7)歲。另收集腦創(chuàng)傷行內(nèi)減壓去除的腦組織36例作為對(duì)照組。每份標(biāo)本都分為2份，一份經(jīng)10%福爾馬林固定，另一份取下后立即用液氮冷凍保存。

1.2 RT-PCR 采用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成，AEG-1上游引物：5′-GGCAATTGGGTAGACGAAGA-3′，下游引物：5′-TTGAATTTGGAGGGATCTCG-3′，引物長度426 bp；MMP-9上游引物：5′-TTCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′，下游引物：5′-CGACACCAAACTGGATGACGC-3′，引物長度：339 bp；β-actin上游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，下游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，引物長度：150 bp。應(yīng)用RT-PCR試劑盒(上海生工生物工程有限公司)按照說明書完成試驗(yàn)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用美國Eagle EyeⅡ型凝膠圖像軟件測定目的基因的吸光度值。

1.3 Western blotting 裂解組織提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。AEG-1、MMP-9蛋白分別于10%、7%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗(Santa公司)兔抗人AEG-1和MMP-9抗體(均為1∶500)孵育，4 ℃過夜。洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000，Santa公司)，室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)轉(zhuǎn)至X光膠片。采用美國Eagle EyeⅡ型凝膠圖像分析系統(tǒng)測定目標(biāo)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的吸光度，取兩者比值作為目標(biāo)蛋白半定量相對(duì)值。

2 結(jié)果

2.1 AEG-1的表達(dá) 與對(duì)照組比較，低級(jí)別組和高級(jí)別組AEG-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低級(jí)別組比較，高級(jí)別組AEG-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1和圖2)。

2.2 MMP-9的表達(dá) 與對(duì)照組比較，低級(jí)別組和高級(jí)別組MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低級(jí)別組比較，高級(jí)別組MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖3和圖4)。

Table1 Comparison of mRNA and protein expression levels of AEG-1 between human glioma group and control group

組別例數(shù)AEG-1/β-actinmRNAAEG-1/β-actin蛋白對(duì)照組360.204±0.078 0.309±0.074 低級(jí)別組320.523±0.116* 0.556±0.108* 高級(jí)別組400.817±0.142*△0.790±0.155*△F值67.82542.013P值 0.000 0.000

注：AEG-1=星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低級(jí)別組比較，△P<0.05

注：AEG-1=星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1

圖1 RT-PCR檢測AEG-1 mRNA表達(dá)水平

Figure1 The expression level of AEG-1 mRNA detected by RT-PCR

圖2 Western blotting檢測AEG-1蛋白表達(dá)水平

Figure2 The expression level of AEG-1 protein detected by Western blotting

Table2 腦膠質(zhì)瘤組與對(duì)照組MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

Table2 Comparison of mRNA and protein expression levels of MMP-9 between human glioma group and control group

組別例數(shù)MMP-9/β-actinmRNAMMP-9/β-actin蛋白質(zhì)對(duì)照組360.229±0.086 0.152±0.039 低級(jí)別組320.458±0.103* 0.298±0.088* 高級(jí)別組400.776±0.128*△0.651±0.117*△F值56.95249.376P值 0.000 0.000

注：MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低級(jí)別組比較，△P<0.05

注：MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9

圖3 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達(dá)水平

Figure3 The expression level of MMP-9 mRNA detected by RT-PCR

圖4 Western blotting檢測MMP-9蛋白表達(dá)水平

Figure4 The expression level of MMP-9 protein detected by Western blotting

2.3 MMP-9與AEG-1表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，MMP-9與AEG-1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.693，P<0.01,見圖5)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生是相關(guān)基因共同參與、相互作用的結(jié)果。AEG-1是近年發(fā)現(xiàn)的新基因，位于8q22，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，其編碼蛋白的異常表達(dá)可以通過多種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化,提高腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力,增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,加速腫瘤新生血管生成[4]。Jeon等[5]于2009 年進(jìn)一步證實(shí)AEG-1是一種新的癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，無論在基因水平還是蛋白水平，腦膠質(zhì)瘤內(nèi)AEG-1的表達(dá)均高于對(duì)照組，

圖5 MMP-9與AEG-1表達(dá)水平的相關(guān)性

這與Yang等[6]的研究結(jié)果一致，提示AEG-1在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中起重要作用。本研究結(jié)果還顯示，AEG-1基因和蛋白在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于在低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)?？梢?，腦膠質(zhì)瘤的惡性程度越高，AEG-1表達(dá)就越高，提示AEG-1在腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過程中起重要的促進(jìn)作用。AEG-1可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路的下游基因P53、FOXO1、FOXO3a、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而介導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的異常增殖和抗凋亡能力。此外，Lee等[7]研究表明，AEG-1激活PI3K/Akt信號(hào)途徑還可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子——低氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)的表達(dá)，后者能夠增加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄水平，從而導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤內(nèi)血管生成增多。Emdad等[8]發(fā)現(xiàn)RNA干擾(RNAi)沉默AEG-1基因后能夠降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。雖然AEG-1促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不明了，但AEG-1仍可作為一項(xiàng)有意義的評(píng)估腦膠質(zhì)瘤惡性程度的指標(biāo)。

MMPs是一類Zn2+依賴性蛋白酶，與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MMP-9是MMPs中分子量最大且最重要的酶，可以降解ECM中的多種蛋白成分，能夠破壞防止腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，從而造成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 mRNA及蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著高于在正常腦組織中的表達(dá)，而且MMP-9在高級(jí)別級(jí)腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著高于在低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，這與Ponnala等[11]的研究結(jié)果一致。在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中，MMP-9通過降解腦膠質(zhì)瘤ECM為腫瘤向正常腦組織侵襲提供通路和空間，對(duì)腦膠質(zhì)瘤的侵襲性生長具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，具有侵襲能力的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌大量的MMP-9，同時(shí)其侵襲力與MMP-9的表達(dá)水平密切相關(guān)[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與AEG-1的表達(dá)呈正相關(guān)，說明AEG-1能夠通過調(diào)控MMP-9的表達(dá)而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Liu等[13]研究表明，AEG-1能夠通過增強(qiáng)MMP-9的表達(dá)而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的侵襲和進(jìn)展。最近研究表明，采用RNAi技術(shù)下調(diào)腦膠質(zhì)瘤中AEG-1 mRNA的表達(dá)后，MMP-9的表達(dá)也顯著下調(diào)[14]。AEG-1能夠激活核因子кB(NF-кB)分子通路，而MMP-9是NF-кB的下游基因，其表達(dá)受NF-кB的調(diào)控，由此推測，AEG-1可能通過NF-кB信號(hào)通路調(diào)控MMP-9的表達(dá)。這些研究結(jié)果提示兩者具有協(xié)同促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤侵襲的作用，從而為進(jìn)一步闡明二者在腦膠質(zhì)瘤中的相互調(diào)控關(guān)系提供了可靠的理論依據(jù)。

總之，AEG-1和MMP-9參與了腦膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲，腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)越高，惡性程度越高，AEG-1和MMP-9的表達(dá)就越高，且二者的表達(dá)具有相關(guān)性。AEG-1和MMP-9協(xié)同促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲，但二者在腦膠質(zhì)瘤中具體相互作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，這將是下一階段研究的重點(diǎn)。本研究豐富了人們對(duì)腦膠質(zhì)瘤基因治療的探索，為腦膠質(zhì)瘤的分子治療提供了新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

1 Yoo BK,Emdad L,Lee SG,et al.Astrocyte elevated gene-1(AEG-1):A multifunctional regulator of normal and abnormal physiology[J].Pharmacology & Therapeutics,2011,130(1):1-8.

2 Gnosa S,Shen YM,Wang CJ,et al.Expression of AEG-1 mRNA and protein in colorectal cancer patients and colon cancer cell lines[J].J Transl Med,2012，11(10):105-109.

3 Louis DN,Ohgaki H,Wiestler OD,et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[J].Acta Neuropathologica,2007,114(2):97-109.

4 Srivastava J,Siddiq A,Emdad L,et al.Astrocyte elevated gene-1 promotes hepatocarcinogenesis:novel insights from a mouse model[J].Hepatology,2012,56(5):1782-1791.

5 Jeon HY,Choi M,Howlett EL,et al.Expression patterns of astrocyte elevated gene-1(AEG-1) during development of the mouse embryo[J].Gene Expression Patterns,2010,10(7/8):361-367.

6 Yang Y,Wu J,Guan H,et al.MiR-136 promotes apoptosis of glioma cells by targeting AEG-1 and Bcl-2[J].FEBS Letters,2012,586(20):3608-3612.

7 Lee SG,Kim K,Kegelman TP,et al.Oncogene AEG-1 promotes glioma-induced neurodegeneration by increasing glutamate excitotoxicity[J].Cancer Research,2011,71(20):6514-6523.

8 Emdad L,Sarkar D,Lee SG,et al.Astrocyte elevated gene-1:a novel target for human glioma therapy[J].Mol Cancer Ther,2010,9(1):79-88.

9 馬順茂，賈漪濤，劉紅磊，等.基質(zhì)金屬蛋白酶7及基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(4)：1324.

10 周少飛，毛偉征，苗蕾,等.基質(zhì)金屬蛋白酶9及其抑制劑與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系[J].疑難病雜志，2012，11(9)：676.

11 Ponnala S,Chetty C,Veeravalli KK,et al.MMP-9 silencing regulates hTERT expression via β1 integrin-mediated FAK signaling and induces senescence in glioma xenograft cells[J].Cellular Signalling,2011,23(12):2065-2075.

12 Asuthkar S,Velpula KK,Chetty C,et al.Epigenetic regulation of miRNA-211 by MMP-9 governs glioma cell apoptosis chemosensitivity and radiosensitivity [J].Oncotarget,2012,3(11):1439-1454.

13 Liu L,Wu J,Ying Z,et al.Astrocyte elevated gene-1 upregulates matrix metalloproteinase-9 and induces human glioma invasion[J].Cancer Research,2010,70(9):3750-3759.

14 劉海燕,張新穎,王立俊,等.siRNA下調(diào)AEG-1表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞MMP-9的表達(dá)及侵襲能力的影響[J].中華小兒外科雜志,2011,32(6):456-460.