王亞嬌，蘇 珂，龍 艷，康 省，于 健，胡 璟，黃漓莉，江仁美

本研究重點

由于飲食控制、服藥依從性差、用藥不合理等多種因素的影響，臨床上糖尿病患者血糖波動較大，降鈣素基因相關(guān)肽是已知舒血管作用最強的多肽。本研究通過建立糖尿病血糖波動模型，從病理、分子方面分析血糖波動和降鈣素基因相關(guān)肽對糖尿病腎病的影響，為揭示糖尿病腎病的病因等提供理論依據(jù)。

糖尿病的主要危害在于長期慢性的高血糖以及其他代謝紊亂導(dǎo)致全身多種組織器官的損傷和功能異常。慢性高血糖主要表現(xiàn)為慢性持續(xù)性高血糖和慢性波動性高血糖，由于受飲食控制不佳、用藥不合理、胰島素抵抗等多種因素的影響，臨床上糖尿病患者的血糖波動較大[1],研究發(fā)現(xiàn)波動性高血糖比持續(xù)性高血糖危害更大[2]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種目前已知的最強的內(nèi)源性舒血管多肽，通過抑制腎血管細胞收縮，增加腎小球毛細血管超濾系數(shù)，改善腎臟微循環(huán)，對腎臟有保護作用[3]。本研究通過建立波動性高血糖糖尿病大鼠模型，觀察比較血糖波動、CGRP與腎功能、腎臟病理之間的關(guān)系，探討其與糖尿病腎病(DN)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量150～200 g，6～8周齡〔桂林醫(yī)學院SPF級實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(桂)2007-0001〕；鏈脲佐菌素(STZ)及枸櫞酸鈉分析純(Sigma公司)；普通胰島素10 ml∶400 U(通化東寶藥業(yè)股份有限公司)；羅氏卓越型血糖儀及配套試紙(瑞士羅氏公司)；CGRP試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；其他試劑及材料均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 40只大鼠按照隨機數(shù)字表法各取8只作為正常對照組(A組)和正常血糖波動組(B組)，其余大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔注射STZ，72 h后取尾血測血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型。符合糖尿病條件的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為糖尿病穩(wěn)定高血糖組(C組)和糖尿病血糖波動組(D組)，每組各8只。糖尿病造模成功后D組每天8:30和14:30腹部皮下注射普通胰島素1～2 U，B組和D組每日8:00和14:00灌葡萄糖2 g/kg，2.0 ml/次，造成血糖波動模型，A組和C組按以上的時間和方法灌0.9%氯化鈉溶液2.0 ml，連續(xù)9周。所有大鼠自由飲水，喂食正常飼料。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 精神、活動、毛發(fā)、飲食等。

1.3.2 生化指標檢測 采用羅氏卓越型血糖儀及配套試紙連續(xù)9周每周進行一次全天7個時間點的血糖檢測，時間分別是8:00、8:30、10:00、14:00、14:30、16:00、20:00。計算每組大鼠平均血糖(MBG)水平，每日血糖水平標準差(SDBG)反映血糖的穩(wěn)定性，最大血糖波動幅度(LAGE)即日內(nèi)血糖最高值與最低值之差。造模9周后，留24 h尿測24 h尿微量清蛋白，禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔麻醉，心內(nèi)取血測血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.3.3 血清CGRP測定 心內(nèi)取血離心后得血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清CGRP水平。

1.3.4 病理標本取材 取左腎，濾紙吸干血跡后電子天平稱重得腎濕質(zhì)量，腎濕質(zhì)量與體質(zhì)量的比為腎指數(shù)(KI)，KI(g/kg)=左腎質(zhì)量/體質(zhì)量，部分腎臟組織用4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察腎臟形態(tài)學的改變并拍照。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體質(zhì)量、KI、MBG、SDBG、LAGE比較 實驗結(jié)束后C組和D組與A組比較，大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)萎靡，毛發(fā)豎起粗糙無光澤，動作反應(yīng)遲鈍，弓背蜷縮，飲水量、飲食量、尿量增加。C組和D組大鼠體質(zhì)量、KI、MBG、SDBG、LAGE與A組和B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組大鼠KI、MBG、SDBG、LAGE與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 4組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA1c、CGRP比較 C組和D組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA1c、CGRP與A組和B組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、CGRP與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SDBG與24 h尿微量清蛋白(r=0.927，P<0.01)、BUN(r=0.883，P<0.01)、Cr(r=0.825，P<0.01)呈正相關(guān),與CGRP呈負相關(guān)(r=-0.823，P<0.01)；CGRP與24 h尿微量清蛋白(r=-0.878，P<0.01)、BUN(r=-0.792，P<0.01)、Cr(r=-0.796，P<0.01)呈負相關(guān)。

2.4 光鏡下大鼠腎臟結(jié)構(gòu)的改變 光鏡下見：A組和B組的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)未見明顯改變。C組和D組較A組出現(xiàn)腎小球囊腔擴張，腎小球細胞減少，炎性細胞浸潤，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，上述變化D組較C組嚴重(見圖1)。

3 討論

DN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)生是由于遺傳、環(huán)境、糖代謝紊亂等多種因素長期共同作用的結(jié)果，超過30%發(fā)展為終末期腎病。Muggeo等[2]對2型糖尿病患者進行了10年的隨訪，發(fā)現(xiàn)血糖變異>18.7%和<11.7%者累計病死率分別為39.6%和23.7%，校正后血糖變異幅度大者發(fā)生死亡的相對危險度為1.68，說明血糖波動大的患者病死率比單純性高血糖高。一項臨床研究顯示HbA1c控制在<6.5%情況下，血糖波動大的2型糖尿病患者更易于誘發(fā)糖尿病微量蛋白尿的發(fā)生[4]。體外基礎(chǔ)研究及血糖波動動物模型研究均表明，波動性高血糖比持續(xù)性高血糖更易促進腎小管上皮細胞凋亡，氧化應(yīng)激水平增高[5]；使腎小球系膜細胞膠原Ⅳ合成增加[6]，加速內(nèi)皮細胞依賴性舒張損傷[7]，加速腎小管間質(zhì)纖維化的進程[8]等，以上研究說明血糖波動比單純性高血糖危害性更大。本研究顯示實驗結(jié)束后D組大鼠的體質(zhì)量、HbA1c與C組無差異，通過量化分析血糖穩(wěn)定性顯示D組的SDBG、LAGE均高于C組，而MBG低于C組，說明D組的日間血糖穩(wěn)定性差，日間血糖波動幅度大，而C組基本處于相對穩(wěn)定的高水平狀態(tài)，A組和B組則在參考范圍。以上結(jié)果說明糖尿病大鼠血糖波動模型造模成功。本研究顯示D組和C組24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr明顯高于A組，D組高于C組。光鏡下腎結(jié)構(gòu)見D組較C組出現(xiàn)明顯的腎小球囊腔擴張，腎小球細胞減少，炎性細胞浸潤，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂。相關(guān)分析顯示SDBG與24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr呈正相關(guān)，以上研究結(jié)果說明血糖波動對糖尿病腎臟的損害比持續(xù)性高血糖更明顯，提示血糖波動可能是DN的獨立危險因素，本研究結(jié)果與相關(guān)報道[4]相似。國內(nèi)外相關(guān)的研究認為波動性高血糖可能易通過不同的代謝途徑激活如核因子κB、谷胱甘肽過氧化物酶、自由基、線粒體超氧陰離子等多種氧化應(yīng)激敏感細胞因子，產(chǎn)生過多的活性氧誘導(dǎo)細胞線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時形成晚期糖基化終產(chǎn)物并沉積，進而啟動或調(diào)節(jié)一些炎性因子、黏附分子等轉(zhuǎn)錄，直接或通過一系列的氧化鏈式反應(yīng)引起血管內(nèi)皮損傷，血管收縮，最終造成血管炎癥、血栓形成、血管基底膜增厚、血管硬化等，加速了DN的發(fā)生發(fā)展[5-7，9-11]。

Table1 Comparison of weight,KI,MBG,SDBG and LAGE in the four groups

組別例數(shù)體質(zhì)量(g)KI(g/kg)MBG(mmol/L)SDBG(mmol/L)LAGE(mmol/L)A組8435±34 3.45±0.31 6.37±0.64 0.55±0.28 1.45±0.67 B組8428±41 3.56±0.29 6.41±0.79 0.68±0.36 1.88±1.15 C組8336±35*△4.67±0.23*△ 24.45±4.13*△ 3.56±1.16*△ 9.89±2.69*△ D組8320±34*△5.26±0.22*△▲20.91±8.67*△▲8.98±1.15*△▲22.17±2.69*△▲F值21.92088.3261956.7331558.1551137.459P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

注：KI=腎指數(shù)，MBG=平均血糖，SDBG=每日血糖水平標準差，LAGE=最大血糖波動幅度；與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

表2 4組大鼠24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA1c、CGRP比較

注：BUN=尿素氮，Cr=肌酐，HbA1c=糖化血紅蛋白，CGRP=降鈣素基因相關(guān)肽；與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

圖1 4組大鼠腎臟形態(tài)學變化(HE染色,×400)

腎臟的血管床有豐富的CGRP受體分布，CGRP通過與這些受體結(jié)合使腎血管舒張、拮抗內(nèi)皮素對血管收縮、抑制血管平滑肌細胞的增殖等，從而增加腎小球濾過率和有效血容量，參與腎臟血流動力學的變化，對腎臟有很好的保護作用[3]。本研究結(jié)果顯示D組和C組的CGRP水平低于A組，相關(guān)分析顯示CGRP和24 h尿微量清蛋白、BUN、Cr之間呈負相關(guān)，說明CGRP與DN相關(guān)，同時提示CGRP可能作為DN的早期預(yù)測因素，與相關(guān)報道[12]相似。本研究顯示D組的CGRP水平較C組降低，SDBG與CGRP呈負相關(guān)，提示血糖波動可能是CGRP的影響因素。已有研究報道體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，波動性高血糖組內(nèi)皮素合成明顯高于持續(xù)高血糖組[13]，內(nèi)皮素增多可使血管內(nèi)皮細胞損傷，導(dǎo)致組織缺血缺氧，使CGRP免疫反應(yīng)纖維減少，CGRP釋放隨之減少，這可能是血糖波動組比持續(xù)高血糖組CGRP水平降低明顯的原因之一[13]。CGRP降低使其對腎臟的保護功能減弱，當循環(huán)中的CGRP顯著減少時內(nèi)皮素的作用也相應(yīng)增強，內(nèi)皮素可引起周圍的血管長時間收縮，加重組織缺血缺氧和血管內(nèi)皮損傷等一系列病理過程，而缺血缺氧又可促進內(nèi)皮素的合成，進一步拮抗了CGRP的作用，形成了惡性循環(huán)，引起微血栓形成、血管平滑肌細胞增殖、血管內(nèi)皮細胞損傷等，最終導(dǎo)致腎功能受損，促進了DN的發(fā)生發(fā)展[3]。

綜上所述，血糖波動與CGRP的降低可能共同參與了DN發(fā)生發(fā)展過程，臨床上應(yīng)減少血糖波動范圍，平穩(wěn)降糖，動態(tài)觀察CGRP的變化，對DN的防治有重要的意義。

本課題人員貢獻：蘇珂負責課題設(shè)計、組織實施、質(zhì)控；龍艷、于健、胡璟負責分子生物學實驗操作；王亞嬌、康省、黃漓莉、江仁美負責動物模型構(gòu)建、統(tǒng)計分析。

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