吳麗丹,馮勝軍,卓華欽，張莞靈，劉華鋒

許多研究證實(shí)尿蛋白在慢性腎臟疾病的進(jìn)展中發(fā)揮了非常重要的作用。尿蛋白的主要作用是能夠活化腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell,rTEC)，使其分泌各種生物活性因子，在腎間質(zhì)中激活成纖維細(xì)胞和趨化炎性細(xì)胞，參與腎間質(zhì)纖維化。而腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同途徑。腎間質(zhì)纖維化與細(xì)胞增殖、凋亡的動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)[1-2]。但是，尿蛋白的性質(zhì)(清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG、40～100 kD血清蛋白等)和嚴(yán)重程度在腎小管間質(zhì)病變進(jìn)展中的作用仍有很大分歧。此外，不論是體外還是動(dòng)物模型中，總是存在一些問題，如大多數(shù)研究?jī)H使用一種或兩種蛋白，或者使用正常血清清蛋白而非患者的血清蛋白對(duì)腎小管細(xì)胞損傷進(jìn)行研究。此外，不同病理類型腎病綜合征患者的尿蛋白能否直接導(dǎo)致rTEC凋亡及其差異性，尚無肯定報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選取臨床上常見的人類不同腎病綜合征患者(微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節(jié)段性腎病綜合征)的完整尿蛋白刺激人腎小管來源的rTEC，分析其凋亡情況，旨在為尿蛋白對(duì)人腎小管-間質(zhì)纖維化的機(jī)制提供重要依據(jù)，為延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展尋找治療新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cell,hrTECs)由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院陳楠教授惠贈(zèng)。相差顯微鏡下可見正常的hrTECs為多角形鵝卵石樣排列，胞體扁平，細(xì)胞緊密銜接，融合成單層。已經(jīng)過鑒定，確認(rèn)為近端hrTECs，保證了本課題以后實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和可靠性。二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Heraeus，Germany)，倒置顯微鏡(MP-50型，Leica Germany)，熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(Leica German)。胎牛血清(Invitrogen)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco,U.S.A)，Hochest 33258(Sigma,U.S.A)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出冷凍hrTECs，37～40 ℃水中快速?gòu)?fù)溶，加適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液(含0.03% L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。0.125%胰蛋白酶(Trysin)-0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)消化傳代。

1.3 尿蛋白的提取與質(zhì)量分析 選取廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科已經(jīng)臨床確診的原發(fā)性腎病綜合征患者(微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節(jié)段性腎病綜合征)的尿蛋白，且無感染并發(fā)癥，尚未應(yīng)用激素及任何免疫抑制劑，腎活檢病理類型分別為微小病變、膜性腎病和局灶-節(jié)段性腎病綜合征。收集入選患者清潔中、后段尿，冷凍離心，飽和硫酸銨沉淀尿蛋白。PEG20000濃縮。超濾滅菌。蛋白濃度定量。-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ羧∫恍〔糠值鞍兹芤盒械鞍踪|(zhì)量驗(yàn)證。蛋白電泳：做該標(biāo)本來源尿液的蛋白電泳，旨在排除尿蛋白在提取過程中是否發(fā)生成分變化；細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)：旨在確保蛋白沒受細(xì)菌污染；蛋白溶液的肌酐水平：旨在看蛋白是否還混有尿液。

1.4 Hoechst 33258染色法觀察細(xì)胞凋亡 hrTECs培養(yǎng)于6孔板中，載玻片爬片，無血清細(xì)胞培養(yǎng)液孵育24 h，使細(xì)胞同步于靜止期，棄上清液，加含尿蛋白培養(yǎng)液，每種病理類型尿蛋白濃度分別為0、1、2、4、8 g/L，孵育細(xì)胞48 h；3∶1的甲醇∶冰醋酸液4 ℃固定5 min，5 mg/L的Hoechst 33258避光染色5 min。選用340 nm的激發(fā)光觀察：在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞呈彌散均勻熒光，凋亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果見到3個(gè)或3個(gè)以上的DNA熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。計(jì)算每孔5個(gè)高倍(×400)視野平均細(xì)胞總數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡百分率?？瞻捉M設(shè)置為無尿蛋白的培養(yǎng)液刺激hrTECs。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)和表面結(jié)構(gòu) 相差顯微鏡下可見正常的hrTECs為多角形鵝卵石樣排列，胞體扁平，細(xì)胞緊密銜接，融合成單層(見圖1)。

圖1 正常DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的hrTECs(×200)

2.2 抽提尿蛋白的質(zhì)量及分析結(jié)果 每種病理類型選擇3例患者，分別抽提出患者的尿蛋白，蛋白溶液的肌酐水平為0.381 μmol/L，均低于人體參考范圍的下限(參考范圍44～133 μmol/L)，鱟實(shí)驗(yàn)確定細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)檢測(cè)值為0.008 EU/ml，亦低于人體參考范圍的下限(0.1 EU/ml)。尿蛋白電泳示各病理類型腎病綜合征患者尿蛋白成分相同，主要為清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG。微小病變腎病綜合征清蛋白83.8%、轉(zhuǎn)鐵蛋白11.9%、IgG 3.4%；膜性腎病綜合征清蛋白56.4%、轉(zhuǎn)鐵蛋白34.6%、IgG 6.9%；局灶-節(jié)段性腎病綜合征清蛋白59.9%、轉(zhuǎn)鐵蛋白15.3%、IgG 13.8%(見圖2)。

圖2 不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白的電泳分析

Figure2 Electrophoretic analysis of urine proteins from patients with three types of nephrotic syndrome

2.3 腎病綜合征患者尿蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 尿蛋白濃度1、2、4、8 g/L時(shí)，膜性腎病綜合征組較微小病變腎病綜合征組細(xì)胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；局灶-節(jié)段性腎病綜合征組較膜性腎病綜合征組和微小病變腎病綜合征組細(xì)胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3組尿蛋白濃度1、2、4、8 g/L時(shí)較空白時(shí)，2、4、8 g/L時(shí)較1 g/L時(shí)，4、8 g/L時(shí)較2 g/L時(shí)，8 g/L時(shí)較4 g/L時(shí)細(xì)胞凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

3 討論

腎功能的進(jìn)展主要取決于腎間質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度。研究表明，尿蛋白可作為獨(dú)立的致病因子，直接造成腎小管間質(zhì)損害[3-4]。對(duì)多種人類和動(dòng)物模型研究提示尿蛋白是參與損傷和加速腎功能惡化的重要因素[5]。其中，rTEC增殖凋亡參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，推測(cè)rTEC的過度凋亡可能是腎小管萎縮的原因，并參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制。在多種腎臟疾病的動(dòng)物模型(如單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型、5/6腎切除模型、高血壓腎硬化模型、慢性環(huán)孢霉素腎病模型、嘌呤霉素氨基核苷慢性腎病模型等)[6-8]以及人體多種腎臟疾病病理標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)纖維化越重的地方，rTEC凋亡數(shù)量越多，間質(zhì)纖維化程度與細(xì)胞凋亡數(shù)量呈正相關(guān)[9]。但是，成分復(fù)雜的尿蛋白中哪種蛋白成分在疾病的發(fā)展過程中具有致病作用，迄今尚無定論。許多研究表明清蛋白導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷。該機(jī)制包括上皮細(xì)胞-成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，細(xì)胞因子以及炎性因子〔單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等〕的分泌、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的聚積、平滑肌蛋白SM22-α表達(dá)等[10-13]。不過這些研究使用了大劑量的純化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白，或許無法真實(shí)模擬尿中清蛋白的作用。另外許多研究表明某些尿蛋白也許不是腎小管間質(zhì)損傷的始動(dòng)因素。Morais等[14]發(fā)現(xiàn)低分子量蛋白不會(huì)影響hrTECs的凋亡，而高分子量蛋白則影響hrTECs的凋亡。并且轉(zhuǎn)鐵蛋白也可以通過hrTECs上調(diào)C3的合成，而不是清蛋白[15]。因此，真實(shí)地分析腎病患者的尿蛋白成分、比例以及與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系，有助于進(jìn)一步了解腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)首先采集尿蛋白，并進(jìn)行質(zhì)量分析(尿蛋白內(nèi)的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞凋亡帶來毒性已經(jīng)排除，肌酐檢測(cè)可以排除尿液成分殘留)，提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性；為了更加明確在腎間質(zhì)損傷中尿蛋白的主要毒性成分，因此對(duì)尿蛋白的組分差異性進(jìn)行分析，通過蛋白電泳提示不同病理類型腎病綜合征患者的尿蛋白成分相同，主要為清蛋白(大部分)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG。其中，微小病變腎病綜合征清蛋白83.8%、轉(zhuǎn)鐵蛋白11.9%、IgG 3.4%；膜性腎病綜合征清蛋白56.4%、轉(zhuǎn)鐵蛋白34.6%、IgG 6.9%；局灶-節(jié)段性腎病綜合征清蛋白59.9%、轉(zhuǎn)鐵蛋白15.3%、IgG 13.8%。采用體外實(shí)驗(yàn)，選取人近端hrTECs株，采用上述人類不同病理類型腎病綜合征患者的完整尿蛋白刺激hrTECs，發(fā)現(xiàn)同一病理來源的尿蛋白的濃度與hrTECs凋亡增加存在劑量依賴關(guān)系，即細(xì)胞凋亡數(shù)量愈多，由于該類蛋白組合源于患者自身的蛋白，尤其是其中的清蛋白占了大多數(shù)，導(dǎo)致hrTECs的凋亡或許與該類蛋白相關(guān)，也旁證了大劑量的純化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)損傷。此外，局灶-節(jié)段性腎病綜合征患者的尿蛋白作用最強(qiáng)，膜性腎病綜合征次之，微小病變腎病綜合征最弱，根據(jù)3類病理類型的尿蛋白的組成可以發(fā)現(xiàn)，IgG的組分含量由多至少分別為局灶-節(jié)段性腎病綜合征、膜性腎病綜合征、微小病變腎病綜合征。Bazzi等[16-17]研究證實(shí)局灶-節(jié)段性腎病綜合征患者尿IgG占總蛋白的比例與節(jié)段性腎小球硬化有相關(guān)性。由此，可以推測(cè)，尿中存在的IgG可能是尿蛋白對(duì)腎小管毒性作用的重要因素，尿IgG的排出可能是腎病進(jìn)展的標(biāo)志之一。由此，可能提示在尿蛋白引起的腎臟纖維化進(jìn)展中，尿清蛋白可能不是最重要的毒性成分。尿蛋白其他成分如脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和補(bǔ)體與腎小管間質(zhì)損害的關(guān)系有待下一步的有關(guān)研究證實(shí)。

表1 不同病理類型腎病綜合征細(xì)胞凋亡率比較Table 1 Comparison of apoptosis rate of hrTECs among different pathological types of nephrotic syndrome

注：與微小病變腎病綜合征組比較，*P<0.05；與膜性腎病綜合征組比較，△P<0.05；與尿蛋白濃度空白比較，▲P<0.05；與尿蛋白濃度1 g/L比較，☆P<0.05；與尿蛋白濃度2 g/L比較，★P<0.05；與尿蛋白濃度4 g/L比較，◇P<0.05

眾所周知，細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程,是機(jī)體清除非機(jī)體所需細(xì)胞、維持自身細(xì)胞穩(wěn)定性的一種特殊的細(xì)胞死亡方式,也是清除異常增殖細(xì)胞的一種重要途徑。以上分析表明，hrTECs的異常凋亡與尿蛋白存在必然關(guān)系，尤其是尿中IgG成分的存在和含量的多少，與hrTECs的凋亡具有重要的因果關(guān)系和劑量關(guān)系，大量腎小管細(xì)胞凋亡，使腎小管局部環(huán)境破壞，這可能是觸發(fā)間質(zhì)細(xì)胞過度增殖，并最終形成纖維化的重要因素。本研究結(jié)果可能為深入闡明腎間質(zhì)纖維化提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，最終將為延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展尋找治療新途徑。

1 劉華鋒，姚翠微，皇甫長(zhǎng)梅，等.白細(xì)胞介素18 對(duì)促進(jìn)腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2004，5(12)：690-693.

2 黃凌虹，張國(guó)強(qiáng)，葉任高，等.細(xì)胞增殖與凋亡在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中的意義[J].中華腎臟病雜志，2000，16 (1)：24-27.

3 Keane WF.Proteinuria： its clinical importance and role in progressive renal disease[J].Am J Kidney Dis，2000，35(4 Suppl 1)：S97-105.

4 Kramer AB,van Timmeren MM,Schuurs TA,et al.Reduction of proteinuria in adriamycin-induced nephropathy is associated with reduction of renal kidney injury molecule(Kim-1) over time[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,296(5):F1136-1145.

5 He FF,Zhang C,Chen S,et al.Role of CD2-associated protein in albumin overload-induced apoptosis in podocytes[J].Cell Biol Int,2011,35(8)：827-834.

6 Wang W，Tzanidis A，Divjak M，et al.Altered signaling and regulatory mechanisms of apoptosis in fecal and segmental glomerulosclerosis[J].J Am Soc Nephrol，2001，12(7)：1422-1433.

7 李里，宮亮，吳玉斌.增殖細(xì)胞核抗原和caspase-3在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)， 2012，15(10)：3489.

8 Faouzi S，burckhardt BE，Hanson JC，et al.Anti-fas induces hepatic chemokines and promotes inflammation by an NF-kappa B-independent，caspase-3-dependent pathway[J].J Biol Chem，2001，276(52)：49077-49082.

9 Wang R，Alam G，Zagariga A，et al.Apoptosis of lung epithelial cells in response to TNF-aipha requires angiotensin Ⅱ generation de novo[J].J Cell Physiol，2000，185(2)：253-259.

10 Wolf G,Ritz E.Combination therapy with ACE inhibitors and angiotensin Ⅱ receptor blockers to halt progression of chronic renal disease:pathophysiology and indications[J].Kidney Int,2005,67(3):799-812.

11 Yu J,Tokinaga Y,Ogawa K,et al.Sevoflurane inhibits angiotensin Ⅱ-induced,protein kinase c-mediated but not Ca2+-elicited contraction of rat aortic smooth muscle[J].Anesthesiology,2004,100(4):879-884.

12 Marshall CB,Krofft RD,Blonski MJ,et al.Role of smooth muscle protein SM22α in glomerular epithelial cell injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2011,300(4):F1026-1042.

13 項(xiàng)新，黃典勝，施燕春，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因-509C/T多態(tài)性與原發(fā)性腎病綜合征相關(guān)關(guān)系的研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2013，16(3)：884-887.

14 Morais C,Westhuyzen J,Metharom P,et al.High molecular weight plasma proteins induce apoptosis and Fas/FasL expression in human proximal tubular cells[J].Nephrol Dial Transplant,2005,20(1):50-58.

15 Tang S,Lai KN,Chan TM,et al.Transferrin but not albumin mediates stimulation of complement C3 biosynthesis in human proximal tubular epithelial cells[J].Am J Kidney Dis,2001,37(1):94-103.

16 Bazzi C，Petrini C，Rizza V，et al.Fractional excretion of IgG predicts renal outcome and response to therapy in primary focal segmental glomerulosclerosis：a pilot study[J].Am J Kidney Dis，2003，41(2)：328-335.

17 Bazzi C，Petrini C，Bizza V，et al.Urinary excretion of IgG and alpha(1)-microglobulin predicts clinical course better than extent of proteinuria in membranous nephropathy[J].Am J Kidney Dis，2001，38(2)：240-248.