張 紅 張志芳 唐利文

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

急性放射性口腔黏膜炎（ROM）是頭頸部惡性腫瘤放射治療的主要劑量限制因素及臨床亟待解決的問題之一，發(fā)病機制尚不明確，涉及多種細胞因子及蛋白的參與［1-3］。 中醫(yī)藥治療取得了不錯的效果［4-6］。 利咽解毒方為我院學術(shù)帶頭人、本文第二作者張志芳教授的自擬方，也是本院治療ROM的常用方。本實驗擬觀察利咽解毒方對ROM的影響，以進一步指導臨床研究，提高急性ROM中醫(yī)治療水平。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠50只，鼠齡10～11周，體質(zhì)量（220±10）g（湖南中醫(yī)藥大學校動物實驗中心提供），雌雄各半，在干燥、空氣流通、12 h光暗交替的條件下自由進食水、食，所有動物在進行實驗前均環(huán)境適應性飼養(yǎng)1周以上，以最大限度降低動物的應激反應，避免對實驗產(chǎn)生干擾。

1.2 藥物與制備 利咽解毒方所用藥物按處方量一次性購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房。將藥物按比例稱取后，水煎，過濾，濃縮，裝入瓶中密封保存于4℃冰箱中，灌胃時水浴至36℃。根據(jù)“常用動物與人體表面積比值表”計算，高劑量組每毫升藥液含生藥0.21 g（相當于臨床用量的20倍），低劑量組每毫升藥液含生藥0.11 g（相當于臨床用量的10倍）

1.3 試劑與儀器 兔抗缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）多克隆抗體；兔抗環(huán)氧化酶-2（COX-2）多克隆抗體；兔抗白介素-6（IL-6）多克隆抗體；即用型SABC免疫組化試劑盒；DAB濃縮顯色試劑盒 （以上所有試劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供）。

1.4 分組與造模 將大鼠隨機分為5組，即空白組、模型組、西藥組、低劑量利咽解毒方組（簡稱低劑量組）和高劑量利咽解毒方組（簡稱高劑量組），每組10只。除空白組不予特殊處理外，其余4組實驗組大鼠均予等劑量、等照射野和等源距的γ線照射。具體方法為：將大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉后，固定在自制的固定夾上，用開口器牽開口腔（口腔以外的部分用5 mm厚的自制鉛板防護裝置防護），用Co60遠距離治療機的γ射線行頰部左右對穿照射，源皮距為80 cm，每次2 Gy，每日1次，每周5次，總劑量均為46 Gy。照射結(jié)束后立即對頰部給予生理鹽水濕潤，最大化減輕對頰黏膜的影響，并把大鼠置于潔凈的保溫盒內(nèi)待其自然蘇醒。

1.5 給藥方法 各組大鼠自造模前30 min用灌胃法給藥1次，給藥容量為10 mL/kg，每日3次，直至完成照射總劑量1周?？瞻捉M及模型組給予生理鹽水，高劑量組給予高劑量利咽解毒方（2.1 g/kg），低劑量組給予低劑量利咽解毒方（1.1 g/kg），西藥組給予西藥混合液（生理鹽水500 mL+利多卡因10 mL+慶大霉素8萬單位+地塞米松5 mg+滅滴靈0.8 mg+小蘇打2.0 mg）。

1.6 觀察指標 （1）動物口腔黏膜的采集及觀察。完成照射總劑量1周后將大鼠斷頸處死，仔細解剖取下口腔頰部黏膜，在濾紙上鋪平，借助放大鏡取典型病變處組織，標本一分為二，一半用甲醛固定 12～24 h，石蠟包埋，制成5～6μm切片，作蘇木精-伊紅染色及免疫組化用；另一半立即置液氮內(nèi)速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ诠鈱W顯微鏡下觀察黏膜形態(tài)（黏膜上皮炎性細胞的多少，有無變性、壞死、潰瘍形成以及成纖維細胞、新生血管等肉芽組織的增生情況）改變。光學顯微鏡下口腔黏膜損傷程度評分標準參照衛(wèi)生部放射性口腔炎診斷標準（0級，口腔黏膜無炎性細胞、壞死、潰瘍等；Ⅰ級，口腔黏膜中有少數(shù)炎性細胞，無壞死及潰瘍；Ⅱ級，口腔黏膜有中量炎性細胞，無壞死及潰瘍；Ⅲ級，口腔黏膜上皮固有層有大量炎性細胞浸潤，小面積壞死，無明顯潰瘍；Ⅳ級，口腔黏膜大面積潰瘍，有壞死組織，其周圍有成纖維細胞、新生毛細血管等）。（2）免疫組化染色劑分析。對頰黏膜組織進行HE染色后，參照何迎春［7］免疫組化方法進行制片機染色等，攝像后，Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對圖片進行分析，測定病變組織中HIF-1α、COX、IL-6的蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16．0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，采用多組均數(shù)比較的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠口腔黏膜形態(tài)分級 大鼠急性ROM模型建立后，正常大鼠頰黏膜呈粉紅色，表面濕潤，物紅腫潰瘍。模型組大鼠接受照射第3周開始出現(xiàn)肉眼可見的紅斑，黏膜下出現(xiàn)充血，隨著放療進行可看到潰瘍加重，增多，并聯(lián)合成片，纖維滲出，形成黃白色假膜，到放療后第7日，所有受照射的部位形成片狀潰瘍。中藥低劑量及高劑量組與西藥組潰瘍出現(xiàn)情況晚，放療結(jié)束后逐漸開始出現(xiàn)，癥狀輕，放療結(jié)束后第7日對各組大鼠頰黏膜形態(tài)進行光學顯微鏡觀察，ROM分級情況見表1。

表1 各組大鼠放療后頰黏膜形態(tài)分級（n）

2.2 各組大鼠急性ROM頰黏膜組織中HIF-1α、COX、IL-6表達的比較 見圖1~圖3，表2。正常組織不表達或很微弱表達HIF-1α、COX、IL-6，模型組頰黏膜組織及其間質(zhì)可見大片或團狀分布的棕黃色顆粒，低劑量組、高劑量組、西藥組HIF-1α、COX、IL-6陽性表達細胞明顯減少，均低于模型組（P＜0.05）。利咽解毒方低劑量及高劑量組與西藥組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中低劑量組蛋白陽性表達均高于高劑量組（P＜0.05）。

圖1 各組HIF-1α免疫組化染色光鏡圖（200倍）

圖2 各組COX-2免疫組化染色光鏡圖（200倍）

圖3 各組IL-6免疫組化染色光鏡圖（200倍）

表2 各組ROM頰黏膜組織HIF-1α、COX-2、IL-6表達水平

表2 各組ROM頰黏膜組織HIF-1α、COX-2、IL-6表達水平

與模型組比較，*P＜0.05；與西藥組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。

?

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學目前對急性ROM的防治沒有統(tǒng)一的標準和特效藥，雖取得了一定療效，但長期療效均不甚理想［7-11］。

急性 ROM 發(fā)病過程中，HIF-1α、COX、IL-6發(fā)揮了重要作用。有實驗表明，HIF-1α在正常的頰黏膜組織中幾乎不表達，而在ROM炎癥組織中表達明顯增強，說明HIF-1α參與了ROM的發(fā)病過程［12］。COX-2在正常頰黏膜組織中幾乎不表達，而在ROM炎癥組織中表達明顯增強，在一定程度上體現(xiàn)著ROM病程的炎癥狀態(tài)［13］。IL-6是放射性損傷最主要的相關因子之一，它除對血管內(nèi)皮細胞及炎癥細胞具有直接地激活和毒性作用外，更主要是誘導急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反應和毒性作用，造成組織細胞的損害，其表達水平與炎性反應的嚴重程度有密切的相關性。實 驗 研 究 證 明［17］，IL-6 與 ROM 關 系 密 切［14-15］， 抑 制IL-6的過量生成，可能會減輕免疫反應導致的上皮組織破壞。

中醫(yī)學認為ROM屬“口瘡”、“口糜”等范疇，惡性腫瘤患者機體正虛邪實，瘀毒內(nèi)結(jié)加之屬火毒之邪的放射線，因此其病機關鍵為“虛”（氣陰兩虛）、“火”（實火、虛火）、“瘀”（氣滯血瘀、氣虛血瘀），虛、火、瘀三者互為因果，相互交結(jié)貫穿本病的始終，熱毒之邪入血分，聚于局部，腐蝕血肉發(fā)為癰腫瘡瘍。利咽解毒方由虎杖、苦參、生地黃、山茱萸、射干、薄荷組成，旨在養(yǎng)陰清熱、解毒利咽。方中生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津；苦參、虎杖清熱解毒；射干、薄荷解毒利咽；山茱萸收斂創(chuàng)面，組方應用符合中醫(yī)理論體系，貼近本病治療實際，在臨床上行之有效，而中醫(yī)治療ROM的機理研究鮮有報道。本實驗結(jié)果顯示各用藥組HIF-1α、COX、IL-6表達較模型組均低，說明HIF-1α、COX、IL-6三者可能介導了急性ROM的發(fā)生發(fā)展過程，利咽解毒方通過減少組織間HIF-1α、COX、IL-6的表達發(fā)揮其抑制效應，其中利咽解毒方低劑量組和高劑量組又低于西藥治療組，說明利咽解毒方具有確切明顯的抗炎療效，且未發(fā)現(xiàn)毒副作用，可以作為治療急性ROM的基礎方用于臨床，臨癥加減，提高放射性口腔黏膜炎的臨床療效。

［1］ 馮崇錦，郭俊兵，蔣宏偉，等．缺氧誘導因子-1α在大鼠放射性口腔黏膜炎中的表達及意義［J］．中國病理生理雜志，2007，23（6）：1223-1227．

［2］ 郭俊兵，朱雙喜，黎熾彬，等．缺氧誘導因子-1α和環(huán)氧合酶-2在大鼠放射性口腔黏膜炎中的表達及意義［J］．中華口腔醫(yī)學研究雜志：電子版，2008，2（3）：217-227．

［3］ 牛艷紅，馮崇錦，黃偉安，等．依達拉奉預防大鼠放射性口腔黏膜炎的初步研究［J］．中華口腔醫(yī)學研究雜志：電子版，2010，4（4）：332-337．

［4］ 張紅，王艷云．急性放射性口腔黏膜反應防治進展［J］．湖南中醫(yī)藥大學學報，2009，29（1）：78-80．

［5］ 楊敏，唐玉平，林高娟．中醫(yī)藥防治放射性口腔炎概況［J］．廣西中醫(yī)藥，2008，31（6）：4-5．

［6］ 陳俏妍，夏紀嚴，韓凌．滋陰清熱法防治陰虛內(nèi)熱證急性放射口腔炎臨床研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30（7）：694-698．

［7］ 陳海燕，馬秀梅，李莉，等．愛維治在治療放射性口腔黏膜炎中的應用［J］．上海交通大學學報，2009，29（8）：1009-1011．

［8］ 付本翠，張健，劉燕，等．金因肽治療ROM的療效觀察［J］．護理研究，2008，22（9C）：2415．

［9］ 呂化真，隋振忠，鄭芳霞，等．思密達局部噴灑對放射性口腔黏膜炎的防治效果觀察［J］．山東醫(yī)藥，2010，50（6）：111．

［10］常韻芳．粒細胞集落刺激因子霧化吸入治療放射性口腔黏膜炎的臨床觀察［J］．醫(yī)護論壇，2009，16（3）：94-95．

［11］肖志平，邱紅，汪銳，等．布地奈德治療急性放射性黏膜炎的療效觀察［J］．臨床口腔醫(yī)學雜志，2010，26（2）：104-106．

［12］ Jung YJ，Isaacs JS，Lee S，et al．IL-1 beta-mediated up-regulation of HIF-1 alpha via an NFkappa B/COX-2 pathway identifies HIF-1 as a critical link between inflammation and oncogenesis［J］．FASEBJ，2003，17（14）：2115-2117．

［13］ Carey MA，Bradbury JA，Seubert JM，et al．Contrasting effects of cyclooxygenase-1（COX-1） and COX-2 deficiency on the host response to influenza a viral infection［J］．J Immunol，2005，175：6878-6884．

［14］郭俊兵，黃偉安，牛艷紅，等．白細胞介素-6在大鼠放射性口腔黏膜炎中的表達及意義［J］．臨床醫(yī)學工程，2011，18（5）：649-651．

［15］Greenfield EM，Bi Y，Miyauchi A．Regulation of osteoclast activity［J］．Life Sci，1999，65（11）：1087-1102．