劉新星，羅俊杰，陳玉梁，陳子萱，裴懷弟，李忠旺

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花和玉米非組培轉(zhuǎn)化方法探索

劉新星，羅俊杰，陳玉梁，陳子萱，裴懷弟，李忠旺

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070）

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法，在棉花和玉米上轉(zhuǎn)化外源目的基因，進行非組培轉(zhuǎn)化法的探索。結(jié)果表明，針刺對棉花和玉米種子的萌發(fā)沒有影響，但對2種作物的出苗率有明顯抑制作用。轉(zhuǎn)化過程中，棉花的共培養(yǎng)時間不宜超過24 h，玉米不宜超過48 h。經(jīng)大田篩選及PCR檢測，棉花未獲得轉(zhuǎn)化植株，玉米獲得轉(zhuǎn)化植株共7株，轉(zhuǎn)化率達0.14%，其中加入AS（乙酰丁香酮）的處理獲得6株，不加AS處理獲得1株。

非組培轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；轉(zhuǎn)化率；棉花；玉米

近年來，植物基因工程技術(shù)取得了重要進展，在農(nóng)作物品種改良和育種方面發(fā)揮著越來越重要的作用。目前植物遺傳轉(zhuǎn)化所采用的受體系統(tǒng)，大都依賴于細胞組織培養(yǎng)技術(shù)才能獲得轉(zhuǎn)基因植株，周期長并存在一定的局限性。因而，一些非組培的轉(zhuǎn)化方法近年來迅速發(fā)展起來［1］，萌動種胚法就是其中一種。剛剛萌動的種胚是最理想的感受態(tài)之一［2～3］，如果在種子吸脹過程中，輔以劃胚處理，從而使細菌有更多的機會進入萌發(fā)胚，使整個胚萌動與發(fā)育這個細胞生長分化極其活躍的過程（2～3 d）均在菌液中進行，萌發(fā)胚的生長點將極易被轉(zhuǎn)化［4］。萌動種胚法主要利用種子萌動時細胞分裂加快、生活力旺盛、具最佳感受態(tài)的特點，一方面靠吸脹作用吸入外源DNA，另一方面輔助劃胚露出生長點，在AS（乙酰丁香酮）作用下，通過活體農(nóng)桿菌對傷口的侵襲作用，從而形成轉(zhuǎn)化分生組織及新的生長點，分化出轉(zhuǎn)化苗。AS是一種酚類化合物，可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中［5］。孫毅等發(fā)明了農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法，已申報中國、美國、加拿大和歐洲發(fā)明專利［6］。梁雪蓮對玉米的試驗證實，此種轉(zhuǎn)化方法既省去繁瑣漫長的組培過程，又可獲得高于基因槍10倍以上的轉(zhuǎn)化率［7］。該方法在玉米上已試驗成功，棉花上還沒有相關(guān)報道。鑒于目前棉花轉(zhuǎn)化困難的最主要原因是難以組培和基因型依賴性強，我們擬利用非組培途徑萌動種胚法轉(zhuǎn)化棉花，采用棉花和玉米作為試驗材料，試圖取得在棉花遺傳轉(zhuǎn)化上的突破。

1 材料與方法

1.1 供試材料及預(yù)處理

1.1.1 供試材料指示棉花品種為隴綠棉3號，玉米品種為隴單023，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。根癌農(nóng)桿菌為LBA4404，所用的植物表達載體為PBI121。

1.1.2 材料預(yù)處理精選經(jīng)硫酸脫絨后的棉花種子，先用70%乙醇涮洗30 s，再用30%過氧化氫浸泡3 h，后用無菌水沖洗5～8遍，在無菌水中浸泡12～16 h催芽至種子露白，于超凈工作臺中剝?nèi)シN皮。用無菌針灸用針在種子胚芽生長點刺2～3下，備用。挑選籽粒飽滿的玉米種子，先用70%乙醇浸泡3min，再用1 g/kg升汞消毒10 min，后用無菌水沖洗3～5次，在無菌水中浸泡5～6h，于超凈臺里用無菌針灸用針在胚芽刺2～3下，備用。

1.1.3 菌液準備將儲存在-70℃冰箱的原始菌液，在含有相應(yīng)抗生素的YEB平板上進行畫線培養(yǎng)，28℃黑暗培養(yǎng)2 d。挑取平板上的單菌落加入含有相應(yīng)抗生素的5 mL YEB液體培養(yǎng)基中，在220 r/min，28℃的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將菌體按1∶50的比例進行二次活化，活化好的菌液離心后用MSB液體重懸菌體，作為共培養(yǎng)液備用。棉花選用卡那霉素為抗性篩選基因的菌液進行介導(dǎo)，玉米選用Basta除草劑為抗性篩選基因的菌液進行介導(dǎo)。

1.2 PCR分子檢測

采集抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株的新鮮葉片，棉花采用本實驗室改良的方法提取基因組DNA［8］，玉米使用試劑盒提取基因組DNA，進行PCR鑒定。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 針刺與菌液共培養(yǎng)對種子萌發(fā)和出苗的影響取未預(yù)處理和經(jīng)過預(yù)處理的棉花種子和玉米種子各100粒，每處理分別置于有菌液的培養(yǎng)皿中黑暗培養(yǎng)，第3天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。后將發(fā)芽的種子播種于含有蛭石的營養(yǎng)缽中，14 d后統(tǒng)計出苗數(shù)。

1.3.2 共培養(yǎng)時間對種子萌發(fā)的影響選取經(jīng)過預(yù)處理的棉花和玉米種子各150粒，每處理50粒種子，分別放入相應(yīng)制備好的共培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在搖床110 r/min下共培養(yǎng)24、36、48 h。然后用無菌水反復(fù)沖洗殘留菌液，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行催芽，統(tǒng)計分析共培養(yǎng)時間對種子萌發(fā)的影響。

1.3.3 AS（乙酰丁香酮）對轉(zhuǎn)化率的影響共設(shè)2個處理，處理1在配制好的菌液中加入200 μmol/L AS，處理2不加AS，2次重復(fù)。將經(jīng)過預(yù)處理的玉米、棉花種子各1 000粒按實驗設(shè)計放置于相應(yīng)菌液中，在搖床110 r/min下玉米培養(yǎng)48 h、棉花培養(yǎng)24 h，然后用無菌水反復(fù)沖洗殘留菌液，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行催芽，待芽長1～2 cm時播種于溫室營養(yǎng)缽內(nèi)，缽內(nèi)為澆有營養(yǎng)液的蛭石。在溫室內(nèi)生長至3～5片葉時進行抗生素涂抹。棉花用3 000 mg/L的卡那霉素篩選，玉米用0.2%Basta除草劑進行篩選。統(tǒng)計加入AS對棉花和玉米轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.4 棉花鑒定抗性植株的篩選時期將經(jīng)過預(yù)處理的棉花種子在制備好的共培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在搖床110 r/min下培養(yǎng)24 h，卡那霉素設(shè)0、100、200、300、400、500 mg/L6個濃度處理，按設(shè)計在MS培養(yǎng)基中分別加入相應(yīng)濃度的卡那霉素，每處理接種50粒棉花種子于黑暗培養(yǎng)，2次重復(fù)，7 d后統(tǒng)計發(fā)芽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 針刺與菌液共培養(yǎng)對種子萌發(fā)和出苗的影響針刺對種子的胚有傷害作用，因而影響到種子的萌發(fā)和出苗率，不同作物種子受針刺后表現(xiàn)也不同。從表1可以看出，針刺與菌液共培養(yǎng)對2種作物種子的萌發(fā)影響不大，對2種作物的出苗率有明顯抑制作用。其中玉米的出苗率為23%，棉花出苗率略低，為17%，均較正常種子菌液培養(yǎng)降低72百分點。觀察發(fā)現(xiàn)，針刺與菌液共培養(yǎng)對棉花幼苗的后期生長有明顯的影響，表現(xiàn)為幼苗子葉發(fā)黃發(fā)枯，新葉生長緩慢，植株生長停滯或逐漸死亡，能夠正常生長至3～5片葉的幼苗僅占6%。

表1 針刺與菌液共培養(yǎng)對種子發(fā)芽數(shù)和出苗數(shù)的影響

2.2 共培養(yǎng)時間對種子萌發(fā)的影響

觀察表明，棉花種子與菌液共培養(yǎng)時間不宜超過24 h，共培養(yǎng)時間為48、60 h處理的種子全部返菌霉變，不能萌發(fā)。玉米種子與菌液共培養(yǎng)時間不宜超過48 h，共培養(yǎng)時間為60 h時，種子感菌不易控制，導(dǎo)致種子霉爛死亡。過長時間與菌液共培養(yǎng)會使種子腐爛發(fā)霉而不能萌發(fā)出苗，這是因為液體中菌體太多，需氧量增大，種子萌發(fā)所需的關(guān)鍵要素氧氣供應(yīng)不足。

2.3 AS（乙酰丁香酮）對轉(zhuǎn)化率的影響

實驗結(jié)果（表2）表明，在菌液中加入200μmol/L AS，可以顯著提高轉(zhuǎn)化率，得到更多的抗性植株。棉花中加AS處理下獲得5株抗性植株，不加AS處理下未獲得抗性植株。玉米中加入AS的處理比不加AS處理獲得的抗性植株數(shù)提高3倍。2.4棉花鑒定抗性植株的篩選時期

表2 添加AS（乙酰丁香酮）處理的種子轉(zhuǎn)化率

從表3看出，加入不同濃度卡那霉素，棉花種子的發(fā)芽率與對照相比無明顯差異，均能正常萌發(fā)出苗。這與王成杰在小麥非組培轉(zhuǎn)化中的結(jié)果一致［9］，說明棉花種子與小麥種子一樣，在含有抗性篩選素的平板上萌發(fā)差異不明顯，達不到篩選目的。因此，棉花只能在萌發(fā)后苗期及其它生育期進行抗性植株篩選。2.5轉(zhuǎn)化植株檢測

表3 不同濃度卡那霉素培養(yǎng)上棉花種子的發(fā)芽率

共轉(zhuǎn)化棉花萌動胚3 000個，獲得抗性植株17株，經(jīng)PCR檢測未得到陽性植株。共轉(zhuǎn)化玉米萌動胚5 000個，獲得抗性植株30株，根據(jù)PCR檢測結(jié)果（圖1）獲得7株陽性植株，其中添加200 μmol/L AS處理下獲得6株，未添加AS處理下獲得1株，轉(zhuǎn)化率共計0.14%。

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米植株P(guān)CR檢測

3 小結(jié)與討論

1）實驗結(jié)果表明，針刺對棉花和玉米種子的萌發(fā)基本沒有影響，但對2種作物的出苗率有明顯抑制作用。轉(zhuǎn)化過程中，與菌液共培養(yǎng)的時間因作物品種而異，棉花共培養(yǎng)時間不宜超過24 h，玉米則不宜超過48 h，時間太短使轉(zhuǎn)化效率降低，過長種子易腐爛，移栽后很難成活。經(jīng)大田篩選及PCR檢測，棉花未獲得轉(zhuǎn)化植株，玉米獲得轉(zhuǎn)化植株共7株，轉(zhuǎn)化率達0.14%，其中加入AS（乙酰丁香酮）的處理下獲得6株，不加AS處理下獲得1株。此方法操作性強，大大優(yōu)于愈傷轉(zhuǎn)化，不依賴組培技術(shù)，結(jié)果穩(wěn)定，很值得推廣。

2）作物種子吸水后，胚內(nèi)的酶活動加強，呼吸作用驟然上升，糖類、蛋白質(zhì)以及核酸的合成和轉(zhuǎn)變也迅速地進行。這時的萌動種胚對外界因子的反應(yīng)十分敏感，胚性細胞開始處于分裂狀態(tài)，子葉對胚芽的包裹不再嚴密。此時利用高活力的農(nóng)桿菌感染處理萌動種胚并進而與之共培養(yǎng)，有利于對種胚生長點的轉(zhuǎn)化，因為宿主細胞DNA的合成和分裂是農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化的一個重要因素。此外萌動種胚的微傷處理不僅利于細菌附著和進入宿主細胞，而且AS可誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒VIR區(qū)基因活化［10］。

3）應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化萌動種胚時，劃胚技術(shù)和工具是關(guān)鍵，需要一定的熟練程度，這樣才不至于嚴重影響劃胚種子的萌發(fā)和出苗［11］。針刺的深度對轉(zhuǎn)化也有很大影響，過深會使胚喪失活性，而過淺則減少農(nóng)桿菌感染的機會。不同的種子形狀、胚的不同位置、種皮厚薄都影響劃胚操作，這些因素的優(yōu)化還有待進一步試驗。

4）雖然這種轉(zhuǎn)化方法具有省時、省工和效率較高等優(yōu)點，但也存在一些問題。這種方法的轉(zhuǎn)化植株可能是嵌合體，會不會穩(wěn)定的進行遺傳，需要進一步研究。同時這種方法的轉(zhuǎn)化效率相對較低，本研究中棉花沒有獲得轉(zhuǎn)化植株也表明該方法可能不適用于部分植物，需要繼續(xù)研究影響轉(zhuǎn)化的因素，提高轉(zhuǎn)化效率［12］?？傊?，高的轉(zhuǎn)化率得益于農(nóng)桿菌生物轉(zhuǎn)化、AS的誘導(dǎo)及萌動種胚感受態(tài)三者綜合作用的結(jié)果。

［1］任海紅，任小俊，王英，等.非組培遺傳轉(zhuǎn)化法在農(nóng)作物上的應(yīng)用［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（11）：85-88.

［2］許耀，王艇，李寶健.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化植物萌動種胚的研究［J］.實驗生物學(xué)報，1991，24（2）：109-114.

［3］楊劍波，許智宏，衛(wèi)志明，等.影響根癌農(nóng)桿菌附著禾谷類作物培養(yǎng)細胞的因素［J］.實驗生物學(xué)報，1993，26（1）：1-6.

［4］SMITH R，HOOD EE.Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons［J］.Crop Science，1995，35：301-309.

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［6］孫毅，王景雪，劉少翔，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法：中國，01104185［P］.2001-07-11.

［7］梁雪蓮.農(nóng)桿菌組培及三種非組培法在小麥和玉米上轉(zhuǎn)化外源Bar基因研究［D］.晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［8］李忠旺，厚毅清，石有太，等.棉花基因組DNA快速提取方法改良［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2012（4）：11-14.

［9］王成杰.農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥非組培轉(zhuǎn)化方法的探討［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［10］楊云霞.小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及比較研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2005.

［11］杜建中，孫毅，郝曜山，等.非組培轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植株及其Basta耐受性研究［J］.西北植物學(xué)報，2012，32（2）：231-240.

［12］王昌濤，趙玉錦，李坤遠，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2007，22（5）：110-113.

（本文責(zé)編：陳偉）

Exploration of the Non-tissue Culture Methods By Agrobacterium-mediated in Cotton and Corn

LIU Xin-xing，LUO Jun-jie，CHEN Yu-liang，CHEN Zi-xuan，PEI Huai-di，LI Zhong-wang
（Institute of Biotechnology，Gansu Academy of Agriculture Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China）

We use a new genetic transformation method by agrobacterium-mediated in germinating embryo of cotton and corn intentioned with Sunyi，to explorated and researched of non-tissue culture transformation.The results shows that the acupuncture has no effect on cotton and corn seed germination，but the germination rate was significantly inhibited in two crops.In transformation process，the co-cultivation timein cotton should not exceed a total of 24 hours，corn should not exceed 48 hours；After field screening and PCR testing，the cotton have not got transformed plants，the corn obtained seven and the conversion rate was 1.4%，in which have six under added AS（acetosyringone）treatment，have one without AS treatment.

Non-tissue culture；Agrobacterium-mediation；Conversion rate；Cotton；Corn

Q781

A

1001-1463（2014）11-0011-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2014.11.004

2014-10-10

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項（2012GAAS15-6；2012GAAS12-2）部分內(nèi)容

劉新星（1986—），女，甘肅平?jīng)鋈?，研究實?xí)員，主要從事作物生理生態(tài)與生物技術(shù)研究。聯(lián)系電話：（0931）7612683。E-mail：lxx19860621@163.com

羅俊杰（1962—），男，陜西華縣人，研究員，主要從事作物生理生態(tài)與培育工作。E-mail：hnsljjie@163.com