王雪峰 韓雪梅 任存霞

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院中醫(yī)臨床基礎教研室，呼和浩特，010059）

王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯對溫病濕熱模型、炎性反應因子IL－1β、IL－6、TNF－α的影響

王雪峰 韓雪梅 任存霞

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院中醫(yī)臨床基礎教研室，呼和浩特，010059）

目的：通過動物實驗觀察王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯對大鼠濕熱模型、炎性反應因子血清白細胞介素1β、白細胞介素6、腫瘤壞死因子α的作用影響。方法：建立大鼠濕熱炎性反應模型，設空白組、模型組、對照藥組、中藥組、蒙藥組分別采取不同處理方法觀察記錄各項指標，血清細胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。結(jié)果：中蒙醫(yī)溫病經(jīng)典方在治療大鼠濕熱癥狀上具有可靠療效，尤其在改善大鼠進食飲水減少，大便稀軟，口角眼角分泌物增多等方面有顯著成效。ELISA檢測顯示對照藥組IL－1β、IL－6、TNF－α無意義，中藥組TNF－α有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），對IL－1β、IL－6無意義（P＞0.05），蒙藥組TNF－α有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）、IL－6有意統(tǒng)計學義（P＜0.05），對IL－1β無意義（P＞0.05）。結(jié)論：王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯在解除濕熱癥狀上有切實可靠的作用，對腹腔炎性反應引起的發(fā)熱及炎性反應，雖然細胞因子血清檢測沒有得出有力檢驗數(shù)據(jù)支持，但動物模型治療后期各項體征監(jiān)測都有好轉(zhuǎn)。ELISA檢測顯示中藥組TNF－α有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；蒙藥組TNF－α有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）、IL－6有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯；濕熱模型；IL－1β；IL－6；TNF－α

通過現(xiàn)代科技手段和實驗研究，對中蒙醫(yī)溫病學經(jīng)典有效代表方劑王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯對濕熱模型、炎性反應因子的影響進行研究。在體外抗輪狀病毒、抗腹瀉、抗菌、解熱（溫熱模型）的實驗研究的基礎上，深入開展系統(tǒng)的動物實驗研究，目的是進一步研究對濕熱模型、炎性反應因子白細胞介素－1β（IL－1β）、白細胞介素－6（IL－6）、血清腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的影響。為發(fā)揮中蒙醫(yī)溫病學有效方劑治療臨床某些病毒感染、細菌性感染、混合性感染等病癥的“雙抗作用”優(yōu)勢，擴大臨床應用范圍提供可靠、科學的實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 動物與飼料 Wistar大鼠74只，雌雄各半，體重（180±20）g，清潔級，購自內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心，動物許可證：SCXK（蒙）2002－0001。普通固體飼料，購自內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心。高脂飼料：每千克普通飼料粉碎后摻加豬油100 g、蛋黃粉80 g、膽固醇25 g、膽酸鈉2 g［1］，塑形烘干。

1.2 藥物 王氏連樸飲加滑石、黃芩（制厚樸6 g、炒川黃連姜汁9 g、石菖蒲3 g、制半夏3 g、炒香豉9 g、焦山梔9 g、蘆根20 g、滑石9 g、黃芩9 g），以上中藥購自內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)院，按文獻方法［2］制備濃縮成1 g/mL的水煎液，根據(jù)實驗需要調(diào)制所需濃度；茵達日－4味湯（連翹40 g、麥冬25 g、拳參35 g、關木通35 g），購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬中蒙醫(yī)院，為散劑，用時微煮，制成混懸液備用。柴連口服液，哈藥集團三精制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：08112114。

1.3 菌株及試劑 大腸埃希氏菌，中國藥品生物制品鑒定所，菌號44101。用營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)24 h，傳代2次，接種到平皿培養(yǎng)24 h，生理鹽水洗脫，麥氏比濁稀釋為109/mL濃度。主要試劑；1）IL－1、IL－6、TNF－α用ELISA檢測試劑盒檢測，北京高博興業(yè)科技有限公司；2）氯化鋇，天津市風船化學試劑科技有限公司生產(chǎn)；3）硫酸，北京興青紅精細化學品科技有限公司生產(chǎn)；4）蛋黃粉、膽酸鈉、膽固醇（鄭州天健食品科技有限公司）。

1.4 主要儀器 清凈工作臺SW－CJ－2FD（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），生化培養(yǎng)箱SPX－150（上海申賢恒溫設備廠），4℃實驗室冰箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生化儀器設備有限公司），電子天平，高壓蒸汽滅菌鍋，高速離心機，電子體溫計，多用溫濕度計，空氣加濕器，酶標儀；造模溫箱自制（木箱結(jié)構，箱子側(cè)壁頂蓋分別留孔換氣）。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組 雌雄分籠飼養(yǎng)，大鼠稱重，適應性飼養(yǎng)期間淘汰一只不合格雄鼠。隨機分為5組，空白組13只、對照藥組14只、中藥組14只、蒙藥組14只、模型組18只。自然環(huán)境，正常飲食，自由攝食進水適應性飼養(yǎng)7 d，每天定期清潔。

1.5.2 造模 空白組：自然環(huán)境正常飲食飼養(yǎng)；模型組：自然環(huán)境下適應性喂養(yǎng)7 d后放入造模溫箱用高脂飼料喂養(yǎng)。溫箱相對濕度85%，溫度33℃，每天造模時間16 h，在大鼠出現(xiàn)濕熱癥狀后大腸桿菌109/（m L·200 g）腹腔注射［3－4］，繼續(xù)放入溫箱造模觀察3 d；中藥組：過程同模型組，注射大腸桿菌后灌服王氏連樸飲加黃芩、滑石方2 g/（mL·200 g），分2次灌服，早晚各1次；蒙藥組：過程同中藥組治療藥物換成茵達日－4味湯；對照藥組：過程同中藥組治療藥物換成柴連口服液治療。

1.5.3 觀察指標及檢測方法 觀察濕熱模型的各項體征（體溫、倦怠嗜臥與否、反應力、活動力、活動量、毛發(fā)、飲食飲水、排便次數(shù)、形狀；眼神、口角與眼角出現(xiàn)分泌物、陰部紅腫、等體征現(xiàn)象）體溫測量在電子體溫計頂端涂少許液體石蠟，輕緩送入大鼠肛門20 cm左右，其他體征1次記錄。檢測目標為TNF－α、IL－1β、IL－6，各組都在濕熱模型組感染大腸桿菌后第3天處死并心臟取血5 mL，4℃3 000 r/min離心10 min，取上清液，4℃保存，待測。各細胞因子測定嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。

2 實驗結(jié)果

2.1 觀察濕熱模型的各項體征 大鼠在造模開始12 d左右陸續(xù)出現(xiàn)倦怠嗜臥，反應遲鈍，活動力下降，活動量減少，毛發(fā)暗淡枯槁，飲食飲水減少，排便次數(shù)增多且大便稀軟，眼無光彩、無神，口角與眼角出現(xiàn)分泌物，陰部紅腫等體征現(xiàn)象，表明出現(xiàn)濕熱癥狀。溫箱造模兩周（出現(xiàn)濕熱癥狀后第3天）進行腹腔注射大腸桿菌，后開始藥物處理、體溫監(jiān)測、特征記錄，每次體溫測量間隔4～6 h，中間隨時觀察各項體征，直至治療結(jié)束。在腹腔感染后6～30 h上述濕熱癥狀和炎性反應表現(xiàn)發(fā)展迅速并達到最為嚴重程度［5］，表明造模成功。在19～35時段雌性模型組與蒙藥組各出現(xiàn)2例死亡大鼠。此段時間大鼠聚堆靜臥基本無活動，飲食飲水基本為零，毛發(fā)枯槁蓬松不潔凈，口角與眼角分泌物不能自潔，肛門括約肌松弛，大便基本不成形，大小便有殘留。治療感染30 h后各項觀察體征開始好轉(zhuǎn)，治療中后期活動量增加，飲食飲水明顯好轉(zhuǎn)增多后期基本恢復正常進食飲水，大便基本恢復正常略為稀軟，眼角口角無明顯分泌物且有自潔能力，毛發(fā)沒恢復光澤，肛門括約肌基本恢復正常，陰部紅腫減輕。

2.2 炎性因子IL－1β、IL－6、TNF－α的檢測及SPSS統(tǒng)計 正式試驗73只大鼠，實驗造模過程中沒有大鼠死亡，注射大腸桿菌開始藥物治療后蒙藥組死2只、模型組死亡2只皆為雌性，雄性對照組死亡一只（麻醉取血時被同籠未麻醉大鼠啃食），最終取得全血標本68份進行血清ELISA檢測。

表1 各組大鼠平均體溫

圖1 大鼠平均體溫走勢圖

表2 血清檢測各組與空白組比較

由血清檢測表可看出，模型組與空白組P值均＜0.05有統(tǒng)計學意義，認為模型組與空白組有差異，其中TNF－α組P值＜0.01有統(tǒng)計學意義，造模成功中藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清TNF－α檢測P值＜0.01，有明顯統(tǒng)計學意義，對IL－1β、IL－6檢測皆P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。蒙藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清TNF－α、IL－6比較可看出P＜0.01、P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，對IL－1β，P＞0.05不具有統(tǒng)計學意義。對照藥治療組對IL－1β、IL－6、TNF－α血清因子影響P值都大于0.05不具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)論

1）王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯在解除濕熱癥狀上有切實可靠的作用。2）中藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清TNF－α檢測P值＜0.01，有明顯統(tǒng)計學意義，對IL－1β、IL－6檢測皆P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。蒙藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清TNF－α、IL－6比較可看出P＜0.01、P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，對IL－1β，P＞0.05不具有統(tǒng)計學意義。

4 討論

在臨床中發(fā)熱、炎性反應可由很多種原因引起，是一種很常見的癥狀，疾病的發(fā)展過程中細菌感染引起的發(fā)熱最為常見?，F(xiàn)代醫(yī)學認為發(fā)熱的機制可以大致概括為，外源性致熱原進入機體產(chǎn)生內(nèi)源性致熱原作用于體溫調(diào)節(jié)中樞使體溫調(diào)節(jié)中樞功能障礙，體溫調(diào)定點上移而引起體溫升高。與發(fā)熱有關的細胞因子主要有白介素－1家族及IL－1受體拮抗蛋白、腫瘤壞死因子－α、白介素－6［6］、干擾素［7］，其中IL－1尤其是IL－1β是參與多種致熱原性發(fā)熱的重要細胞因子［8］，TNF－α是介導炎性反應反應的主要細胞因子是重要的內(nèi)生性致熱原，也是一個比較重要的前炎性反應因子及抗腫瘤因子［9］。TNF－α能進一步誘導IL－6等細胞因子的產(chǎn)生，這些促炎性細胞因子參與體內(nèi)急性反應、發(fā)熱反應、引起趨化膚釋放等，還可使內(nèi)皮細胞活化而導致血管通透性增加［10］。

王氏連樸飲出自《霍亂論》，由著名醫(yī)家王士雄創(chuàng)制。由制厚樸、黃連、石菖蒲、制半夏、香豉、焦山梔、蘆根組成，后世溫病學家在本方基礎上加滑石、黃芩，沿用至今。本方具有辛開苦降，清熱化濕的功效，是治療濕熱性疾病的代表方，最初為治療濕熱霍亂主方，目前臨床治療濕熱中阻等病證，以發(fā)熱汗出不解，心中煩悶，脘痞腹脹，嘔吐腹瀉，便溏色黃，口渴不欲多飲，尿赤澀，舌紅，苔黃膩，脈滑數(shù)等癥狀為主。蒙醫(yī)溫病學方劑茵達日－4味湯又名音達日－西湯，是蒙藥臨床的傳統(tǒng)方劑，茵達日－4味湯在蒙藥經(jīng)典古籍《四部醫(yī)典》中有明確記載，由連翹、麥冬、拳參、木通組成，具有清熱、解毒、止瀉的功效，主治腸熱痢疾、腹痛、腹瀉等病證，用于小腸熱證，是蒙醫(yī)臨床治療熱瀉的經(jīng)典方劑。

大鼠濕熱模型并炎性反應的實驗研究表明中蒙醫(yī)溫病經(jīng)典方在治療大鼠濕熱癥狀上具有明顯效果，尤其在改善因濕熱導致大鼠進食飲水減少，大便稀軟，口角眼角分泌物增多方面在經(jīng)過2 d治療后已有明顯成效。在治療的第2天大鼠因濕熱引起的諸多癥狀都有不同程度緩解改善［11］，因濕熱性疾病屬臨床難治性、頑固性疾病，中蒙醫(yī)溫病經(jīng)典方王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯對濕熱模型的癥狀的顯著改善，再一次驗證了中蒙醫(yī)藥治療濕熱的綜合生物效應，即多靶點、多途徑、多作用的結(jié)果。溫病濕熱模型的濕與熱偏重不同［12］也影響著TNF－α、IL－6、IL－1β的含量［13］。有報道表明在輪狀病毒感染時宿主發(fā)生特異性和非特異性免疫反應，而IL－6、IL－1β以及TNF－α是感染早期非特異性及隨后發(fā)生的抗原特異性免疫間的功能性橋梁，在不同時期其含量也不同［14］。實驗藥物的劑量對中醫(yī)藥治療疾病也有重要影響［15］。

通過實驗可以認定王氏連樸飲加滑石、黃芩；茵達日－4味湯在解除濕熱癥狀上有切實可靠的作用。對腹腔炎性反應引起的發(fā)熱及炎性反應，在動物模型治療后期各項體征監(jiān)測都有好轉(zhuǎn)。中藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清TNF－α檢測P值＜0.01，有明顯統(tǒng)計學意義，蒙藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清TNF－α、IL－6比較可看出P＜0.01、P＜0.05，有顯著統(tǒng)計學意義。此結(jié)果進一步揭示了王氏連樸飲加滑石、黃芩；劑茵達日－4味湯在抗炎中分子生物學的作用機制。中藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清IL－1β、IL－6檢測P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；蒙藥治療組對溫病發(fā)熱炎性反應模型血清IL－1β，P＞0.05不具有統(tǒng)計學意義，推測這可能與IL－1β、IL－6、TNF－α在機體中作用時間、在血清中存在時段不同有關，或藥物達到預定效果治療時間不夠等有關。

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（2014－05－27收稿 責任編輯：徐穎）

Wangshilianpu Drink Plus Talcum，Baical Skullcap Root and Yindari-4 Decoction Treating Animal Model of W arm Disease w ith Dam p-heat Syndrome and Its Effects on the Inflammation Factors of IL-1β，IL-6 and TNF-α

Wang Xuefeng，Han Xuemei，Ren Cunxia
（Department of Traditional Chinese Medicine，Inner Mongolia Medical University，Hohot010059，China）

Objective：To observeWangshilianpu drink plus talcum，baical skullcap rootand Yindari-4 decoction treating ratmodelswith damp-heat syndrome，and its effect on inflammatory factors of Factors of IL-1β，IL-6 and TNF-α.Methods：Damp heat inflammation of ratsmodelwas set up，and there were four groups of rats including the blank group，model group，control group，the Chinese medicine group，and Mongolianmedicine group.Different treatmentswere conducted and index，serum cytokines beta，IL-6，IL-1 TNF alpha test were observed by using enzyme-linked immunosorbent（ELISA）.Results：The classic prescriptions of Chinese and Mongolian medicine treating warm diseases had reliable efficacy in the treatment of ratswith damp-heat symptoms，especially in improving the reduced intake ofwater，runny stool and spatcanthus secretion.ELISA detection showed that therewas no significant improvement in the controlgroup in terms of IL-1β，IL-6 and TNF-αbeta；Chinese traditionalmedicine group showed obvious difference in terms of TNF-α（P＜0.01），and there was no significant improvement on IL-1 beta and IL-6（P＞0.05）；the Mongolian group showed significant improvement on IL-6（P＜0.05）and TNF-αv（P＜0.01），and no significantdifference on IL-1βv（P＞0.05）.Conclusion：Wanglianpu drink plus talcum，baical skullcap rootand Yindari-4 decoction on relieving symptoms of damp-heat syndrome ispractical and reliable.As for fever and inflammation caused by abdominal inflammation，although cytokines serum does not draw strong inspection data support，but the animalmodels have better physical signs in the late phase of treatment.ELISA detection shows that Chinese traditional medicine group has obvious difference in TNF alpha（P＜0.01），and the Mongolianmedicine group has obvious improvement in TNF alpha（P＜0.01）and significant improvement in IL-6（P＜0.05）.

Wanglianpu drink plus talcum，Baical skullcap root and Yindari-4 decoction；Damp-heat syndrome；IL-1β；IL-6；TNF-α

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.11.033

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金重點項目（編號：2010Zd34）

王雪峰（1987—），男，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學2012級在讀研究生

韓雪梅（1956—），女，本科，教授，碩士研究生導師，研究方向：中醫(yī)溫病方藥的臨床應用與實驗研究，E－mail：hanxuemeihaohao＠sina. com