魏丹蕾周毅業(yè)李思寧簡小兵陶有青王文英符路娣賴圓瑾

（1廣州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州，510130；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，廣州，510405；3世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會，北京，100101；4廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州，510006；5廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州，510130）

實(shí)驗(yàn)研究

歸龍湯對糖尿病血管病變大鼠免疫機(jī)制的影響

魏丹蕾1周毅業(yè)1李思寧2簡小兵1陶有青3王文英1符路娣4賴圓瑾5

（1廣州市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州，510130；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，廣州，510405；3世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會，北京，100101；4廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州，510006；5廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州，510130）

目的：探討歸龍湯對糖尿病血管病變大鼠免疫的影響。方法：將80只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、西洛他唑組、歸龍湯（低、中、高）劑量組，并造糖尿病血管病變大鼠模型?？瞻讓φ战M和模型對照組的大鼠每日喂飼蒸餾水；西洛他唑組每日喂飼西洛他唑片1.67 mg/kg；歸龍湯組予以不同劑量的歸龍湯灌胃。用藥56 d后，犧牲實(shí)驗(yàn)大鼠，測定大鼠血清中血糖及免疫指標(biāo)的水平，同時(shí)取大鼠主動(dòng)脈弓下段2～3 cm主動(dòng)脈，在光鏡下觀察主動(dòng)脈粥樣硬化病變及其程度。結(jié)果：糖尿病血管病變大鼠的免疫指標(biāo)中IgM、IgA和C3升高，IgG降低。低、中、高劑量的歸龍湯均能使糖尿病血管病變大鼠的免疫指標(biāo)恢復(fù)正常。結(jié)論：歸龍湯能夠有效調(diào)節(jié)糖尿病血管病變大鼠免疫失衡狀態(tài)。

歸龍湯；糖尿病血管病變；免疫；大鼠

糖尿病足是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，具有患病率高、危害性大、可防難治的特點(diǎn)，加強(qiáng)對糖尿病足的早期干預(yù)有著非常重要的現(xiàn)實(shí)意義［1］。大量的研究表明糖尿病及糖尿病足與免疫密切相關(guān)［2－4］，因此，通過調(diào)節(jié)糖尿病足患者的免疫狀態(tài)，是防治該病的途徑之一。為此，本研究建立糖尿病血管病變大鼠動(dòng)物模型，用具有溫陽養(yǎng)血活血作用的歸龍湯對糖尿病血管病變大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠免疫相關(guān)指標(biāo)：IgM、IgG、IgA、C3、C4的水平變化，探討歸龍湯對糖尿病血管病變大鼠免疫因素的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量150～180 g，鼠齡6～8周。

1.2 藥物與制劑

1.2.1 西洛他唑片 規(guī)格：50 mg/片（國藥準(zhǔn)字H20040579號，西安大恒制藥生產(chǎn)）。

1.2.2 歸龍湯 組成：當(dāng)歸尾10 g，赤芍15 g，桂枝10 g，地龍12 g，路路通12 g，細(xì)辛6 g，銀杏葉12 g。制法：由廣州市中醫(yī)醫(yī)院煎藥室濃縮煎煮成湯劑，再分別配成含生藥濃度為4 g/mL煎劑作歸龍湯高劑量，含生藥濃度為2 g/mL煎劑作歸龍湯中劑量，含生藥濃度為1 g/mL煎劑作歸龍湯低劑量，然后放入4℃冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 分為空白對照組（n＝10），模型對照組（n＝10），西洛他唑組（n＝15）、歸龍湯低劑量組（n＝15）、歸龍湯中劑量組（n＝15）、歸龍湯高劑量組（n＝15）。

1.3.2 糖尿病血管病變大鼠模型制備 隨機(jī)抽取70只大鼠給予高糖高脂飼料（普通飼料67.5%、蔗糖20%，精煉豬油10%、膽固醇2.0%、豬膽鹽0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%），并給予10 mg/（kg·d）一氧化氮合成酶（Nitric Oxidesvnthase，NOS）抑制劑－N－硝基－L－精氨酸甲醋（L－NAME）灌胃；其余10只大鼠作為空白對照組予普通飼料飼養(yǎng)；每只大鼠共飼養(yǎng)28 d。第29 d，所有高糖高脂飲食大鼠禁食≥10 h后腹腔注射STZ 25～30 mg/kg，空白對照組大鼠注入同體積的檸檬酸鈉緩沖液。注射后72 h，測各鼠FBG或OGTT－2hBG。FBG≥7.8 mmol/L或2hBG≥11.1 mmol/L的提示糖尿病大鼠造模成功。糖尿病大鼠按體重和血糖值分入模型對照組、西洛他唑組、歸龍湯低、中、高劑量組，繼續(xù)喂飼高糖高脂飼料及L－NAME灌胃，連續(xù)28 d，翌日檢測所有大鼠的空腹血糖，同時(shí)抽取2只模型對照組大鼠并處死，取主動(dòng)脈弓下段2～3 cm主動(dòng)脈，用于觀察主動(dòng)脈粥樣硬化病變及其程度，判斷糖尿病血管病變大鼠是否成模。

1.3.3 糖尿病血管病變大鼠成模標(biāo)準(zhǔn) 從以下兩方面判定糖尿病血管病變大鼠模型是否成功。1）血糖：FBG≥7.8 mmol/L或2hBG≥11.1 mmol/L。2）取實(shí)驗(yàn)大鼠主動(dòng)脈弓下段2～3 cm主動(dòng)脈，主動(dòng)脈于10%中性甲醛溶液中固定48 h后進(jìn)行脫水、石蠟包埋后切片作常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察主動(dòng)脈粥樣硬化病變及其程度。光鏡下如可見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，其下聚集大量泡沫細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，彈力纖維斷裂，血栓形成，證實(shí)動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣硬化典型病變。

1.3.4 給藥方法 糖尿病血管病變大鼠成模后，空白對照組和模型對照組每日喂飼蒸餾水，西洛他唑組每日喂飼西洛他唑片1.67 mg/kg，歸龍湯高、中、低劑量組每日分別給予高、中、低劑量的歸龍湯4 mL灌胃，共用藥56 d。

1.3.5 血清標(biāo)本采集和檢測 給藥至第56天禁食≥10 h，第57天用血糖儀測全血FBG后，對照組和藥物組分別靜脈注射2.78 mol/L葡萄糖溶液或葡萄糖－藥物混合液20 mL/kg后2 h，測2 hBG，隨后喂食至22：00。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食≥10 h，翌日取血，血標(biāo)本于1 h內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，取血清保存于－20℃冰箱內(nèi)待測，所有標(biāo)本收集完成后同批測定以減少批間差異。采用常規(guī)生化、ELISA或RIA方法檢測各組大鼠FBG，IgM、IgG、IgA、C3、C4。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料分別采用配對t檢驗(yàn)和組間t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)；等級資料采用秩和檢驗(yàn)，分別統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病血管病變大鼠造模成功后大鼠存活情況

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，造模前，空白對照組和模型對照組分別入選10只，其他4組各入選15只。但由于本實(shí)驗(yàn)在糖尿病血管病變大鼠成模前未對高血糖等因素予以干預(yù)，在糖尿病大鼠或糖尿病血管病變大鼠成模前，除空白對照組外，其余5組均有實(shí)驗(yàn)大鼠死亡或被處死，故實(shí)際用藥大鼠相應(yīng)減少。實(shí)驗(yàn)不同階段大鼠的數(shù)量詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)不同階段各組內(nèi)大鼠的數(shù)量（只）

表2 糖尿病大鼠成模時(shí)各組空腹血糖水平的比較（mmol/L）

圖1 主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹增生

圖2 主動(dòng)脈內(nèi)血栓形成

表3 用藥前后各組糖尿病血管病變大鼠空腹血糖水平的比較（mmol/L）

2.2 糖尿病血管病變大鼠模型評價(jià)

2.2.1 血糖水平評價(jià) 模型對照組、西洛他唑組、歸龍湯低劑量組、歸龍湯中劑量組、歸龍湯高劑量組的空腹血糖均大于7.8 mmol/L，與空白對照組比較，明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這5個(gè)組之間的空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.2.2 主動(dòng)脈粥樣硬化病變及其程度 光鏡下觀察大鼠主動(dòng)脈標(biāo)本，可見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹增生，主動(dòng)脈內(nèi)血栓形成（見圖1和圖2），說明造模成功。

2.3 歸龍湯對糖尿病血管病變大鼠FBG的影響 表3提示與空白對照組相比，其他各組在用藥前和用藥后的空腹血糖均明顯升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但西洛他唑組及歸龍湯低、中、高劑量組的組內(nèi)空腹血糖在用藥前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明西洛他唑片和歸龍湯都不具降血糖作用。

2.4 歸龍湯對糖尿病血管病變大鼠免疫指標(biāo)的影響

表4中模型對照組、西洛他唑組及歸龍湯低、中、高劑量組與空白對照組的免疫指標(biāo)比較后提示，糖尿病血管病變大鼠存在IgM、IgA和C3升高，IgG降低，C4變化不明顯，大部分免疫指標(biāo)的變化，說明糖尿病血管病變大鼠的機(jī)體存在免疫異常。經(jīng)使用歸龍湯后，歸龍湯低、中、高劑量組的IgM、IgG、IgA和C3與空白對照相應(yīng)的免疫指標(biāo)的水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明低、中、高劑量的歸龍湯均能使糖尿病血管病變大鼠的免疫指標(biāo)恢復(fù)正常。使用低、中、高劑量的歸龍湯均能降低IgM，這3組的IgM水平較模型對照組低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低、中、高劑量的歸龍湯組均能升高IgG，與模型對照組的IgG比較，歸龍湯中、高劑量組更為明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。歸龍湯的不同劑量組均能降低糖尿病血管病變大鼠的IgA和C3，在降低IgA方面，與模型對照組比較有差異，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不同劑量的歸龍湯3組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對照組比較，只有中、高劑量的歸龍湯能夠有效降低C3。與模型對照組比較，西洛他唑組的IgA有降低，且比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不能降低IgM、C3或升高IgG，說明西洛他唑片不能從總體上改善糖尿病血管病變大鼠免疫異常狀態(tài)。

表4 各組用藥后免疫指標(biāo)水平的比較（g/L）

3 討論

糖尿病與免疫的關(guān)系已有諸多的研究，免疫調(diào)節(jié)異?？赡茉谔悄虿“l(fā)生發(fā)展過程中起核心作用［5－7］。近來年隨著對糖尿病足研究的深入，大量的研究表明糖尿病的血管病變與周圍神經(jīng)病變均與免疫密切相關(guān)［8－10］。糖尿病足患者可能存在免疫系統(tǒng)的損害，其表現(xiàn)為一種滲出性和壞死性炎癥，全身及局部可能存在免疫失衡［11］。徐冬巖［12］研究顯示單純糖尿病組和糖尿病足部感染組血清lgG較健康老年人組明顯下降，且以單純糖尿病組下降更為顯著，IgA和IgM水平在3組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)：與單純糖尿病患者及健康人比較，0級糖尿病足患者存在明顯的免疫失衡狀態(tài)［13］。這些研究提示我們改善糖尿病患足者免疫失衡狀態(tài)，可以早期干預(yù)糖尿病足和預(yù)防糖尿病足潰瘍的發(fā)生。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為陽氣損傷是糖尿病足形成的重要病機(jī)［14］。歸龍湯為當(dāng)歸四逆湯加味而成，其中當(dāng)歸四逆湯出自張仲景的《傷寒論》，當(dāng)歸四逆湯具有溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈功效［15］。歸龍湯在當(dāng)歸四逆湯的基礎(chǔ)上加銀杏葉、地龍、路路通，去木通、甘草、大棗組成，諸藥合用，活血通絡(luò)而無傷陰之弊，寒溫并用既不溫燥耗津，又不寒涼留滯，共奏溫陽養(yǎng)血，活血通絡(luò)之功。

本研究證實(shí)具有溫陽養(yǎng)血活血作用的歸龍湯能夠降低糖尿病血管病變大鼠的IgM、提升其IgG，有效調(diào)節(jié)了糖尿病血管病變大鼠免疫狀態(tài)。

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（2014－08－01收稿 責(zé)任編輯：張文婷）

Effect of Guilong Decoction on Imm une M echanism of Rats w ith Diabetic Angiopathy

Wei Danlei1，Zhou Yiye1，Li Si'ning2，Jian Xiaobing1，Tao Youqing3，Wang Wenying1，F(xiàn)u Ludi4，Lai Yuanjin5
（1 Guangzhou Hospital of TCM，Guangzhou 510130，China；2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3World Federation of Chinese Medicine Societies，Beijing 100101，China；4 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；5 The Affiliated Guangzhou TCM Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China）

Objective：To investigate the effect of Guilong decoction on the immunemechanism of rats with diabetic angiopathy.Methods：Eighty rats were random ly divided into blank control group，model control group，cilostazol group，Guilong（low，middle，high dose）group.Models of ratswith diabetic angiopathy weremade.Rats in the blank control group and themodel control group were daily fed with distilled water.The cilostazol group daily fed ratswith 1.67 mg/kg cilostazol；Guilong decoction group gave different doses of Guilong decoction.After 56 days，the experimental ratswere killed，and the blood glucose and immune indices in serum of ratswere detected.The atherosclerotic aortic lesionswere observed under the microscope.Results：IgM，IgA and C3 immune indexes of diabetic angiopathy in rats were increased，IgG was decreased.The high，middle and low dose Guilong decoction could return the immune index in ratswith diabetic angiopathy to normal.Conclusion：Guilong decoction can effectively regulate the immune imbalance of ratswith diabetic angiopathy.

Guilong decoction；Diabetic angiopathy；Immune；Rats

R285.5；R587.1；R392.11

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.11.032

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2011B061300064）；廣東省中醫(yī)藥局科研課題（項(xiàng)目編號：20111024）

魏丹蕾，廣州市荔灣區(qū)珠璣路16號，Tel：（020）81226233，E－mail：939762912＠qq.com