鄧義德易躍能徐月燦，2陳 鋒肖滿意劉湘榮

（1湖南希爾藥物研究有限公司，長沙，410205；2湖南希爾天然藥業(yè)有限公司，永州，425000）

抗氧化成分白藜蘆醇的樹脂分離工藝研究

鄧義德1易躍能1徐月燦1，2陳 鋒1肖滿意1劉湘榮1

（1湖南希爾藥物研究有限公司，長沙，410205；2湖南希爾天然藥業(yè)有限公司，永州，425000）

目的：研究大孔吸附樹脂分離純化虎杖中白藜蘆醇的工藝條件及參數(shù)。方法：利用白藜蘆醇顯酸性的特點，采用堿液洗脫樹脂法分離純化白藜蘆醇?？疾?種樹脂、堿的濃度以及洗脫流速等因素對白藜蘆醇分離純化的影響。結果：選擇NKA-Ⅱ樹脂，NaOH洗脫液濃度0.5%，流速為1 BV/h，經(jīng)過去鹽后，白藜蘆醇純度達到70%以上。結論：該工藝適用于對白藜蘆醇有吸附的樹脂，經(jīng)過一次上柱就可以與原料中其他干擾成分分離，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

白藜蘆醇；虎杖；大孔吸附樹脂；堿

虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物（Polygonum CuspidatumSieb.et Zucc）的干燥根莖和根，是我國的一種傳統(tǒng)中藥［1-2］，具有祛風利濕，散瘀定痛，止咳化痰等功效?，F(xiàn)代藥學研究證明其具有多種藥理作用，主要表現(xiàn)在抗癌和抗心血管疾病兩個方面［3-4］?；⒄戎泻熊晤惢衔铩⑤祯惢衔?、黃酮類化合物、水溶性多糖、鞣質(zhì)和微量元素等成分［5］，其主要活性成分白藜蘆醇（Resveratrol）是一種多酚物質(zhì)，生產(chǎn)工藝一般采用大孔吸附樹脂分離純化白藜蘆醇，但易受到蒽醌類、虎杖苷等的干擾，需要用不同濃度的乙醇洗脫，重復多次地上柱。本實驗根據(jù)白藜蘆醇的特點，使用堿液洗脫，取得了良好的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 虎杖購自長沙市高橋中藥材專業(yè)市場，產(chǎn)自廣西，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》2010年版一部虎杖項下規(guī)定；白藜蘆醇對照品為自制（含量98.7%）；酒曲（安琪酵母股份有限公司）；硅膠G254（青島海洋化工廠分廠）；S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、X-5、D101樹脂（天津南開大學化工廠）；AB-8樹脂（西安電力樹脂廠）；氫氧化鉀、氫氧化鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司）；甲醇、乙醇、鹽酸等試劑為分析純；乙腈（色譜純），水為娃哈哈純凈水。

Agilent1260高效液相色譜儀；AG285分析天平（德國梅特勒公司，精密度：d＝0.01 mg）；DZF-6050真空干燥箱（上?，樮帉嶒炘O備有限公司）；EYELA SB-1100型旋轉蒸發(fā)儀；超聲清洗器（寧波科生儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 上柱液的制備［6-10］稱取虎杖粉末，加入藥材重的0.5%酒曲，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至5，于40℃下酶解3 h。酶解后加入10倍量80%乙醇，70℃回流提取2次，2 h/次，過濾液回收乙醇，剩余液備用。1.2.2 分析方法［11-13］

1.2.2.1 色譜條件 Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（25∶75）；檢測波長307 nm；流速為1 mL/min；柱溫30℃；進樣量10μL。

1.2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取7.5 mg白藜蘆醇對照品，加無水甲醇50 m L配制成0.15 mg/mL的標準儲備液。精密吸取標準儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0mL置10mL容量瓶中，無水甲醇定容至刻度。依次取10μL進樣，每個濃度重復3次，以峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（X）為橫坐標，得回歸方程y＝238 722x-459 7，r＝0.999 7，線性范圍為白藜蘆醇0.15～0.75μg。

1.2.3 大孔吸附樹脂的選擇［14-22］樹脂的吸附性能對白藜蘆醇的純化影響很大，不同的樹脂純化效果有較大差別。試驗測定了6種樹脂靜態(tài)吸附量、吸附率和解吸率，比較他們的吸附率和解吸率，選擇出較為理想的樹脂。精確稱取經(jīng)預處理的一定質(zhì)量的6種樹脂，置于具塞的錐形瓶中，加入40 mL的虎杖上柱液，于室溫下連續(xù)振蕩24 h，轉速為130 r/min，測定吸附前后白藜蘆醇濃度的變化，按下式計算各樹脂的靜態(tài)吸附容量和吸附率，然后用60%乙醇水溶液進行洗脫，測定脫附液中白藜蘆醇的含量，按下式計算解吸率。

吸附量（mg/g干樹脂）＝（C0-Ce）×VA/W

吸附率＝（C0-Ce）/C0×100%

解吸率＝CD×VD/［（C0-Ce）×VA］×100%

式中C0為吸附液起始濃度，Ce為吸附平衡濃度，VA為吸附液體積，W為樹脂質(zhì)量，CD為脫附液濃度，VD為脫附液體積。

1.2.4 靜態(tài)吸附實驗 取1 g樹脂加入40 mL 0.92 mg/mL白藜蘆醇溶液，在不同時刻取少量溶液分析白藜蘆醇質(zhì)量濃度，以吸附時間為橫坐標，吸附量為縱坐標做出樹脂的吸附動力學曲線。取1 g樹脂加入40 mL系列質(zhì)量濃度的白藜蘆醇溶液，進行吸附試驗，測定吸附前后的溶液中白藜蘆醇質(zhì)量濃度，計算樹脂吸附量。

1.2.5 解吸條件的選擇 對已經(jīng)吸附樣品的樹脂進行脫附試驗，作出解吸曲線?？疾靿A液濃度、流速等因素對樹脂脫附性能的影響，確定最佳的工藝條件。

2 結果

2.1 樹脂的篩選結果 在相同試驗條件下，測得各樹脂的靜態(tài)吸附及脫附，結果見表1。根據(jù)表1綜合樹脂對白藜蘆醇吸附和解吸性能的考慮，選用NKA-Ⅱ樹脂來考察分離純化虎杖中白藜蘆醇的工藝。

2.2 靜態(tài)吸附動力學過程 配制濃度為0.92 mg/mL白藜蘆醇溶液40 mL，加入已處理好的1gNKA-Ⅱ樹脂，在不同時刻取少量溶液分析白藜蘆醇濃度，繪制吸附動力學曲線，結果見圖1?？梢?，開始階段，隨吸附時間增加吸附率快速增加，吸附時間越長，吸附越接近平衡，150 min開始，吸附量增加緩慢。

2.3 上樣濃度對吸附效果的影響 配制6份不同濃度的上柱液，每份均超樹脂的飽和吸附量，結果見圖2?？梢?，隨著溶液中白藜蘆醇濃度的增加，樹脂的吸附量增加很快，當濃度≥800 mg/L后，吸附量趨于平穩(wěn)。

表1 6種樹脂對白藜蘆醇的吸附、解吸性能

圖1 靜態(tài)吸附動力學過程曲線

圖2 上樣濃度對吸附效果的影響曲線

2.4 洗脫劑濃度對NKA-Ⅱ樹脂動態(tài)脫附性能的影響 實驗室前期試驗發(fā)現(xiàn)，用特定濃度強堿溶液洗脫，可以很好地分離蒽醌類、白藜蘆醇苷等干擾成分。將已吸附好樣品的樹脂用5個NaOH梯度濃度進行洗脫，檢測洗脫液的白藜蘆醇濃度，計算洗脫率，結果見表2、圖3。從表2數(shù)據(jù)、圖3可以看出，當NaOH洗脫濃度≥0.5%時，白藜蘆醇的洗脫率有很大程度的提升，也減少了洗脫溶劑；同時白藜蘆醇與其他干擾成分得到分離，提高了產(chǎn)品中白藜蘆醇的純度，考慮到堿濃度大對生產(chǎn)設備的損耗，確定將0.5%的NaOH溶液作為洗脫液。

表2 洗脫劑濃度對洗脫性能的影響

圖3 不同NaOH洗脫濃度得到的樣品TLC圖譜

2.5 洗脫液流速的確定 平行裝4支NKA-Ⅱ樹脂柱，用3.5BV 0.5%NaOH洗脫液按不同流速進行洗脫，收集洗脫液，測定白藜蘆醇濃度，計算解吸率，結果見圖4。表明低流速有利于提高白藜蘆醇的解吸率，在1.0 BV/h的流速下，洗脫率達到91.7%，從提高生產(chǎn)效率出發(fā)，確定洗脫流速為1.0BV/h。

圖4 洗脫流速對洗脫率的影響

2.6 產(chǎn)品純度的測定 按優(yōu)選工藝條件，收集堿洗脫液，用稀鹽酸調(diào)pH值至5，對水透析24 h，濃縮、真空干燥，經(jīng)高效液相色譜測定產(chǎn)品中白藜蘆醇純度為79.1%，見圖5-C。

3 結論

1）本實驗利用白藜蘆醇的顯酸性的特點，通過試驗的篩選，確定在0.5%濃度的NaOH溶液洗脫條件下，產(chǎn)品中白藜蘆醇純度為79.1%。該工藝具有一次上柱與其他干擾成分分離的效果，在提高白藜蘆醇純度的同時，簡化了生產(chǎn)工藝。

2）達到一定的堿濃度下，對考察的其他5種樹脂也做了優(yōu)選工藝條件的驗證試驗，白藜蘆醇均能與干擾物質(zhì)分離，達到較高的純度。

3）關于洗脫原理有待進一步的研究，可能與改變樹脂的吸附性能有關，但與堿液降低樹脂的吸附能力又有差異，因為在選擇的堿液濃度下，虎杖苷及蒽醌類物質(zhì)并沒有洗脫下來，針對性比較強。

圖5 產(chǎn)品的HPLC圖譜

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（2013-11-12收稿 責任編輯：曹柏）

Optim ization of the Purification Techniques of Resveratrol by M acroporous Adsorption Resin

Deng Yide1，Yi Yueneng1，Xu Yuecan1，2，Chen Feng1，Xiao Manyi1，Liu Xiangrong1
（1 Hunan Hill Natural Pharmaceutical Co．Ltd．，Changsha 410205，China；2 Hunan Hill NaturalsCo．Ltd．，Yongzhou 425000，China）

Objective：To explore purification techniques of Resveratrol bymacroporous adsorption resin.Methods：As resveratrol is acidic，lye elution resin separation and purification was used.The impact of resin types，NaOH concentration，flow rate on purification resultswere explored.Results：The optimized purification techniques was：NKA-Ⅱresin，eluent concentration of NaOH 0.5%，flow rate＝1BV/h，after desalting，resveratrol purity＞＝70%.Conclusion：The optim ized purification techniques is applicable to adsorption resin that is resveratrol adsopting，separation with other ingredients can be achieved by one flow，it is suitable formass production.

Resveratrol；Cuspidatum；Macroporous resin；A lkali

R331；R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.032

鄧義德（1981—），男，工程師，研究方向：中藥資源開發(fā)與利用，E-mail：dyidandg2008＠163.com

易躍能，執(zhí)業(yè)藥師，在讀博士后，主要從事新藥研究工作，Tel：（0731）82193577，E-mail：yiyueneng＠163.com