龍建飛張秋霞鄒海艷趙 暉王 蕾邊寶林趙海譽

（1首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京，100069；2中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700）

實驗研究

黃連解毒湯有效部位調控VEGF表達對中動脈栓塞大鼠海馬神經元的保護

龍建飛1張秋霞1鄒海艷1趙 暉1王 蕾1邊寶林2趙海譽2

（1首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京，100069；2中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京，100700）

目的：觀察黃連解毒湯有效部位（總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜）對中動脈栓塞大鼠海馬神經元的保護作用。并通過檢測缺血中心區(qū)（尾殼核）和遠隔腦區(qū)（海馬）血管內皮生長因子VEGF的表達，探討其作用機制。方法：建立中動脈栓塞大鼠模型，免疫熒光染色技術觀察神經元核蛋白NeuN及血管內皮生長因子VEGF的表達。結果：腦缺血7 d大鼠海馬神經元核蛋白NeuN表達下調，尾殼核、海馬VEGF免疫染色強度降低，差異較假手術組有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。黃連解毒湯水提取物和總黃酮可提高海馬神經元NeuN表達（P＜0.05）；總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜組大鼠海馬CA1區(qū)VEGF表達較模型組增強（P＜0.05）；總黃酮還可明顯上調尾殼核VEGF表達（P＜0.01）。結論：黃連解毒湯總黃酮對缺血中心區(qū)、遠隔腦區(qū)VEGF均有調節(jié)作用，可減輕腦梗死遠隔部位海馬CA1區(qū)神經元繼發(fā)性損害。

黃連解毒湯；中動脈栓塞；神經核抗原；VEGF

臨床和實驗研究表明，大腦中動脈缺血后，腦梗死損害并不僅僅限于梗死灶局部，遠隔缺血腦區(qū)海馬CA1區(qū)也會出現(xiàn)神經元變性［1］。采取有效手段減輕腦梗死遠隔部位繼發(fā)性損害，對卒中康復具有重要意義。黃連解毒湯源于唐·王燾《外臺秘要》，可用于急性腦卒中及腦血管后遺癥的臨床治療［2-4］，本研究重點觀察黃連解毒湯水提物3個主要有效部位（總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜）對中動脈栓塞大鼠海馬神經元標記蛋白NeuN表達的影響，并通過檢測缺血中心區(qū)（尾殼核）和遠隔腦區(qū)（海馬）血管內皮生長因子VEGF的表達，探討黃連解毒湯對腦梗死后遠隔腦區(qū)繼發(fā)性損害的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，體質量320～350 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗條件下自然飲食，適應環(huán)境3 d后進行實驗。

1.2 受試藥物 黃連解毒湯水提物及3個有效部位（總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜），由中國中醫(yī)科學院中藥研究所提供。水提取物粉末得率為20%；總生物堿主要成分有黃連堿、表小檗堿、小檗堿、巴馬汀，質量分數(shù)為48.50%；總黃酮主要成分是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，質量分數(shù)為32.22%；總環(huán)稀醚萜主要成分是梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷，質量分數(shù)為43.08%。

1.3 試劑 鼠抗NeuN（Millpore，Cat.＃MAB377，Lot＃1991263）；兔抗VEGF（Abcam，批號：ab46154）；二抗：Alexa Flur 488標記山羊抗小鼠IgG、Dylight594-山羊抗兔IgG（北京中杉金橋有限公司）。

1.4 儀器 全自動脫水機（BLEICA ASP300型，德國）；輪轉式石蠟切片機（LEICA RM2235型，德國）；攤片機（LEICA HI1210型，德國）；包埋機（LEICA EG1150H型，德國）；Nikon生物顯微鏡、NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)（日本）。

2 方法

2.1 中動脈栓塞大鼠模型制備 參照文獻［5］制作。大鼠麻醉后，分離右頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）及頸外動脈（ECA），同側頸總動脈永久結扎，于ECA與ICA分叉處作一切口，將制備好的線栓沿CCA順行插入，插入深度為距動脈分叉17～18 mm，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導致腦缺血。動物入選的標準：大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)明顯左側偏癱體征（不能完全伸展左前肢、行走時向左側傾倒或轉圈者）納入，無此體征者被棄去。2.2 分組、給藥 黃連解毒湯3個有效部位的給藥劑量由藥理實驗動物與人體臨床等效劑量換算而成。實驗大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、總生物堿組44 mg/kg、總黃酮組50 mg/kg、總環(huán)烯醚萜組80 mg/kg。造模后2 h給藥組大鼠灌胃給藥1次，造模24 h再次灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，1次/d，給藥體積為0.5 mL/100 g。假手術組、模型組灌胃等容量生理鹽水。

2.3 取材與標本處理 缺血7 d后，每組隨機取4只大鼠，麻醉后，進行4%多聚甲醛心內灌注固定，恒定灌注時間45 min，待固定充分后，開顱取腦，切取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm組織塊，投入相同固定液于4℃固定1周后，常規(guī)石蠟包埋，切片。

2.4 免疫熒光組織化學染色 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（PH6.0）20 min修復抗原，10%羊血清封閉，每片滴加一抗70μL（NeuN抗體稀釋1∶100、VEGF抗體稀釋1∶200），于濕盒中4℃孵育40 h。每片滴加二抗試劑70μL，室溫孵育2 h后，0.01M PBS洗滌，DAPI封片。2.5 圖像處理 NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)采集每張切片右側（缺血側）遠隔腦區(qū)海馬CA1區(qū)以及缺血腦區(qū)尾殼核相互不重疊的5個視野，分析每個視野的陽性表達，以熒光強度反映陽性表達的免疫強度。

3 結果

3.1 黃連解毒湯有效部位對中動脈栓塞大鼠海馬神經元NeuN表達的影響 NeuN為神經細胞特異性抗體，可反映神經元損傷程度。圖像分析結果顯示，腦缺血7 d大鼠海馬CA1區(qū)神經元NeuN表達較假手術組明顯下調（P＜0.05）。水提取物和總黃酮可明顯提高海馬CA1區(qū)神經元NeuN熒光強度，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（見表1）

表1 黃連解毒湯有效部位對海馬CA1區(qū)神經元NeuN表達的影響（±s，例數(shù)＝4）

表1 黃連解毒湯有效部位對海馬CA1區(qū)神經元NeuN表達的影響（±s，例數(shù)＝4）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

熒光強度假手術-1410.59±673.60組別劑量（mg·kg-1）* 80 1204.70±631.36模型-892.55±481.11水提取物800 1447.45±988.36**總生物堿44 764.48±617.70總黃酮50 1382.20±799.60*總環(huán)烯醚萜

3.2 黃連解毒湯有效部位對中動脈栓塞大鼠VEGF表達的影響 VEGF是血管新生的正性調節(jié)因子，同時又是一個多效性的神經保護因子。圖像分析結果顯示：腦缺血7 d大鼠海馬CA1區(qū)、尾殼核VEGF表達較假手術組明顯下調（P＜0.05）；黃連解毒湯水提取物及3個有效部位總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜均可明顯上調海馬CA1區(qū)VEGF表達（P＜0.05），總黃酮還可增強缺血中心區(qū)尾殼核VEGF的熒光強度，較模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（見表2）

表2 黃連解毒湯有效部位對腦缺血大鼠VEGF表達的影響（±s，例數(shù)＝4）

表2 黃連解毒湯有效部位對腦缺血大鼠VEGF表達的影響（±s，例數(shù)＝4）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

91.09±34.73模型-159.66±104.19 49.13±25.68水提取物800 172.98±93.99 115.40±96.91**總生物堿44 146.63±76.30 92.17±81.87*總黃酮50 310.38±247.86**112.97±92.42**總環(huán)烯醚萜80 200.13±158.57 103.43±78.77尾殼核海馬CA1區(qū)熒光強度假手術-69.80±45.83*組別劑量（mg/kg）*

附圖：

圖1 黃連解毒湯有效部位對大鼠腦缺血7 d海馬CA1區(qū)神經元NeuN表達的影響（免疫熒光染色，×400）

圖2 黃連解毒湯有效部位對大鼠腦缺血7 d后海馬CA1區(qū)VEGF表達的影響（免疫熒光染色，×400）

4 討論

NeuN是神經元的標志蛋白，在缺血、缺氧、神經損傷等多種病理條件下，NeuN免疫活性的降低可誘導神經元的死亡［6］。在本次實驗中我們觀察到中動脈栓塞7 d大鼠海馬CA1區(qū)神經元NeuN表達明顯減弱，結果進一步證實大腦中動脈栓塞后并不直接影響海馬的供血，卻引起了海馬神經元變性［1］。同時我們注意到，伴隨神經元NeuN免疫活性降低，缺血中心區(qū)尾殼核及遠隔腦區(qū)海馬血管內皮生長因子VEGF表達明顯下調。結果提示，中動脈栓塞后遠隔缺血區(qū)海馬神經元變性與血管內皮生長因子的表達變化存在必然的聯(lián)系。

黃連解毒湯源于唐·王燾《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，為清熱解毒代表方?；A研究與臨床報道表明黃連解毒湯可用于治療缺血性腦血管病［2，7-11］。本次實驗重點對黃連解毒湯3個主要有效部位總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜防治腦梗死后遠隔部位繼發(fā)性損害的作用進行了研究。結果顯示，黃連解毒湯水提物及有效部位總黃酮可明顯增強中動脈栓塞大鼠海馬CA1區(qū)NeuN陽性表達，提示總黃酮是黃連解毒湯減輕海馬CA1區(qū)神經元損傷的主要有效部位。VEGF是高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂因子［12］，不僅可誘導內皮細胞增殖及毛細血管瓣生成，促進微血管形成，有利于側支循環(huán)的建立［13-14］，還能直接作用于皮質、海馬、小腦神經細胞，發(fā)揮神經營養(yǎng)效應和神經再生作用［12-15］。已有報道表明，黃連解毒湯可促進VEGF表達［16］，對多種因素誘導的神經細胞損傷具有保護作用［17-18］。在此基礎上，我們進一步分析了黃連解毒湯總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜對中動脈栓塞大鼠缺血中心區(qū)尾殼核及缺血遠隔腦區(qū)海馬VEGF表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)總黃酮、總生物堿、總環(huán)烯醚萜均可增加遠隔腦區(qū)海馬VEGF表達，而總黃酮還可明顯上調缺血中心區(qū)VEGF表達。綜合本次實驗結果，我們認為黃連解毒湯總黃酮可通過調節(jié)缺血中心區(qū)、遠隔腦區(qū)血管內皮生長因子，發(fā)揮神經營養(yǎng)效應，對減輕腦梗死后遠隔部位繼發(fā)性損害具有重要意義。

［1］Kirino T.Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia［J］.Brain research，1982，239（1）：57-69.

［2］李銳朋.黃連解毒湯治療腦梗死急性期火熱證32例臨床觀察［J］.福建中醫(yī)藥，2010，41（5）：16-17.

［3］陳隱漪.黃連解毒湯對急性腦梗死患者的血清IL-6、TNF-a的影響［J］.首都醫(yī)藥，2007（8）：35-36.

［4］陳國華，單萍，邱昕.黃連解毒湯治療老年性癡呆（心肝火旺型）臨床研究［J］.中國中醫(yī)急癥雜志，2007，16（4）：386-387，434.

［5］田金洲.血管性癡呆［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：598-607.

［6］Kirino T.Delayed neuronal death［J］.Neuropathology，2000，20（7）：S95 -S97.

［7］青發(fā)基.加味黃連解毒湯治療急性腦梗死48例臨床觀察［J］.安徽中醫(yī)臨床雜志，2001，13（5）：329-330.

［8］張建平.黃連解毒湯為主治療急性腦血管病50例［J］.實用中醫(yī)藥雜志，1998，14（9）：10.

［9］溫躍才.加味黃連解毒湯治療腦梗塞100例［J］.吉林中醫(yī)藥，1998，18（1）：27.

［10］史一峰，陳維澤.黃連解毒湯治療中風后遺癥34例［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學，1996，5（3）：50-52.

［11］唐曉玲，唐敏.黃連解毒湯臨床研究進展［J］.實用中西醫(yī)結合臨床，2010，10（5）：90-92.

［12］Margaritescu O，Pirici D，Margaritescu C.VEGF expression in human brain tissue after acute ischemic stroke［J］.Rom JMorphol Embryol，2011，52（4）：1283-1292.

［13］Dzietko M，Derugin N，Wendland M F，et al.Delayed VEGF Treatment Enhances Angiogenesis and Recovery After Neonatal Focal Rodent Stroke［J］.Transl Stroke Res，2013，4（2）：189-200.

［14］Sun Y，Jin K，Xie L，et al.VEGF-induced neuroprotection，neurogenesis，and angiogenesis after focal cerebral ischemia［J］.Journal of Clinical Investigation，2003，111（12）：1843-1851.

［15］Namiecinska M，Marciniak K，Nowak JZ.VEGF as an angiogenic，neurotrophic，and neuroprotective factor［J］.Postepy Hig Med Dosw，2005，59：573-583.

［16］Ye Y，Huang C，Jiang L，et al.Huanglian-Jie-Du-Tang extract protects against chronic brain injury after focal cerebral ischemia via hypoxia -inducible-factor-1alpha-regulated vascular endothelial growth factor signaling in mice［J］.Biol Pharm Bull，2012，35（3）：355-361.

［17］王志潭，竇錦明，王修彬，等.黃連解毒湯藥效部位對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用研究［J］.山東中醫(yī)雜志，2012，31（5）：354-356.

［18］吳彥，孫建寧，張愛林，等.黃連解毒湯有效部位對實驗性腦缺血的保護作用［J］.中藥材，2004，27（5）：357-360.

（2014-04-03收稿 責任編輯：曹柏）

Active Fractions of Huanglian Jiedu Decoction Regulating the Exp ression of VEGF and Protecting the Hippocampal Neurons of Ratswith M idd le Cerebral Artery Occlusion

Long Jianfei1，Zhang Qiuxia1，Zou Haiyan1，Zhao Hui1，Wang Lei1，Bian Baolin2，Zhao Haiyu2
（1 School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Key Laboratory for Collateral-Disease Theory of TCM，Beijing 100069，China；2 Instituteof ChineseMateia Madica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100070，China）

Objective：To investigate the effects of Huanglian Jiedu Decoction（HLJDDAF）which consists of total alkaloids，total flavonoids and total iridoids on the expression of VEGF in caudate putamen and hippocampal CA1 region of rats afterm iddle cerebral artery occlusion and to explore the mechanism of the effects.Methods：Cerebral ischemia was induced by midd le cerebral artery occlusion（MACO）.The expressions of NeuN and VEGFwere observed by immunofluorescence staining.Results：The expression of NeuN in distant brain regions of rats inmodelgroup were significantly reduced，and the expression of VEGF in caudate putamen and hippocampal region were reduced compared with those of the sham group（P＜0.01-0.05）.Aqueous extract，total flavonoidswere capable of increasing the expression of the NeuN compared with those of themodel group（P＜0.01-0.05）；total alkaloids，total flavonoids and total iridoidswere capable of increasing the expression of the VEGF in hippocampal CA1 region compared with those of themodel group（P＜0.01-0.05）.Especially the total flavonoids also increased the expression of VEGF in caudate putamen（P＜0.01）.Conclusion：Total flavonoids of HLJDD is inherently capable of regulating the expression of VEGF in caudate putamen and distant brain regions，and reducing hematogenously secondary damage of hippocampal CA1 region after cerebral infarction.

HLJDDAF；Middle cerebral artery occlusion；NeuN；VEGF

R289.9；R-332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.023

國家科技支撐計劃課題“中藥有效成分群功效關聯(lián)性評價技術研究”（編號：2008BAI51B02）；北京市自然科學基金（編號：7102014，編號：7122018）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃-長城學者項目資助（編號：CIT＆TCD20140329）；北京市屬高等學校人才強教深化計劃“中青年骨干人材培養(yǎng)計劃”項目（編號：PXM2011014226）

龍建飛，女，2012級在讀碩士研究生，E-mail：ljfbeijing2012＠163.com

趙暉，女，博士研究生，副教授，E-mail：zhaohui8957＠sina.com；王蕾，女，博士研究生，教授，E-mail：tmwangl＠ccmu.edu.cn