陳紅，劉春蘭，王亞彬，倪龍鳳

(九江市中心血站，江西九江332000)

·調(diào)查報(bào)告·

獻(xiàn)血者HBV、HCV、HIV檢測(cè)模式探討

陳紅，劉春蘭，王亞彬，倪龍鳳

(九江市中心血站，江西九江332000)

目的對(duì)獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行HBV、HCV、HIV的ELISA檢測(cè)、NAT檢測(cè)和確證試驗(yàn)，在保證血液安全的前提下，選擇最佳的獻(xiàn)血者HBV、HCV、HIV的檢測(cè)模式。方法2003年9月1日至2014年8月31日九江血站采集的無償獻(xiàn)血樣本共43473例，用兩種ELISA試劑進(jìn)行HBV、HCV和HIV檢測(cè)，檢測(cè)陰性樣本和單試劑陽性的樣本進(jìn)行NAT檢測(cè)，單試劑樣本分別進(jìn)行確證試驗(yàn)。結(jié)果42161例ELISA陰性樣本有75例NAT陽性，陽性率0.18%；45例HBV單試劑陽性樣本有7例NAT陽性，有2例確認(rèn)試驗(yàn)陽性(其中1例NAT陽性)；18例HCV單試劑陽性樣本NAT未檢出陽性，確證試驗(yàn)5例不確定；15例HIV單試劑陽性樣本NAT未檢出陽性，確證試驗(yàn)1例不確定，追蹤為陰性。結(jié)論開展NAT檢測(cè)十分必要，但NAT檢測(cè)不能完全代替ELISA檢測(cè)，獻(xiàn)血者的HBV、HCV、HIV檢測(cè)模式選用一種ELISA試劑加一種NAT試劑檢測(cè)能最大限度地防止陽性樣本的漏檢，更好地保障血液安全。

ELISA檢測(cè)；核酸檢測(cè)；確證試驗(yàn)；血液安全

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.053 2012年6月

衛(wèi)生部頒布了新的《血站技術(shù)操作規(guī)程》[1]，獻(xiàn)血者乙型肝炎病毒(HBV)感染標(biāo)志物、丙型肝炎病毒(HCV)感染標(biāo)志物和人類免疫缺陷病毒(HIV)感染標(biāo)志物的檢測(cè)方法可以用兩種不同生產(chǎn)廠家的酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑或一種ELISA試劑加一種核酸擴(kuò)增(NAT)試劑檢測(cè)。我國(guó)從2010年開始在血站進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)的試點(diǎn)工作，目前關(guān)于我國(guó)獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)的功效仍在研究中[2]?，F(xiàn)在很多血站在采用兩次ELISA后再加做一次NAT，檢測(cè)成本巨大。本站通過對(duì)獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行HBV、HCV、HIV的ELISA檢測(cè)、NAT檢測(cè)和確證試驗(yàn)，在保證血液安全的前提下，選擇最佳的獻(xiàn)血者HBV、HCV、HIV的檢測(cè)模式。

1 材料與方法

1.1 材料2013年9月1日-2014年8月31日九江地區(qū)無償獻(xiàn)血者共計(jì)43473例，體檢合格后采血，同時(shí)留取2管5±1ml樣本，其中1管用EDTAK2抗凝的真空采血管，用于ELISA檢測(cè)，1管用無菌、無DAN酶、無RNA酶、帶分離膠的EDTA-K2抗凝BD真空采血管，用于核酸檢測(cè)。所有樣本在2～8℃保存，1600g離心20min，48h內(nèi)完成ELISA和NAT檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 ELISA試驗(yàn)乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑(英科新創(chuàng)科技有限公司、北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司、珠海麗珠試劑股份有限公司)、丙型肝炎病毒抗體診斷試劑(英科新創(chuàng)科技有限公司、北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)、人類免疫缺陷病毒HIV1/2抗體診斷試劑(上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司)，人類免疫缺陷病毒HIV1/2抗原抗體診斷試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司)，試劑均通過中國(guó)藥品生物制品檢定所批批檢合格，且在有效期內(nèi)使用；檢測(cè)用澳斯邦全自動(dòng)加樣儀STAR和全自動(dòng)酶免儀FAME完成，在校驗(yàn)期內(nèi)使用。

1.2.2 核酸試驗(yàn)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒(1+2型)核酸聯(lián)合檢測(cè)試劑(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)，在有效期內(nèi)使用；檢測(cè)用美國(guó)羅氏Cobas S201全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)(包括Hamilton STAR全自動(dòng)混樣儀、Cobas Ampilprep核酸提取儀和Cobas Taqmen Analyzer核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀)完成，在校驗(yàn)期內(nèi)使用。

1.2.3 確認(rèn)試驗(yàn)乙型肝炎病毒表面抗原確認(rèn)試劑(珠海麗珠，批號(hào)2014060248)、丙型肝炎病毒抗體確證試劑(北京萬泰，批號(hào)RC20140101)、人類免疫缺陷病毒HIV1/2抗體確證試劑(MP生物醫(yī)學(xué)亞太有限公司,批號(hào)AE3031)，在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 ELISA試驗(yàn)用2種ELISA試劑進(jìn)行HBV、HCV、HIV檢測(cè)，每次檢測(cè)嚴(yán)格按試劑說明書操作，陰陽性對(duì)照成立，室內(nèi)質(zhì)控在控。任何1種試劑S/ CO值≥1.0為反應(yīng)性,0.85≤S/CO值＜1.0為灰區(qū)，任一種試劑檢測(cè)為反應(yīng)性或灰區(qū)的，則重取血袋導(dǎo)管血雙試劑雙孔平行復(fù)試，復(fù)試后任1種試劑任1孔呈反應(yīng)性或灰區(qū)的，判為陽性。

1.3.2 核酸試驗(yàn)淘汰ELISA試驗(yàn)雙試劑陽性的樣本，陰性和HBV、HCV、HIV單試劑陽性的樣本由全自動(dòng)混樣儀自動(dòng)混樣，每6份樣本(167μl/份)混合成1份(1ml)作為一級(jí)混樣池(pool)樣本,由全自動(dòng)核酸提取儀和全自動(dòng)核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀采用核酸定性篩查試劑進(jìn)行HBV-HCV-HIV NAT檢測(cè)。每批檢測(cè)均設(shè)置1個(gè)陰性質(zhì)控和5個(gè)陽性質(zhì)控，每個(gè)pool均含內(nèi)對(duì)照。pool檢測(cè)為陰性，6份樣本合格；pool檢測(cè)為反應(yīng)性，對(duì)該pool中的6份樣本進(jìn)行單份拆分檢測(cè)，拆分試驗(yàn)為陰性判定為NAT檢測(cè)陰性，反之拆分試驗(yàn)為反應(yīng)性判定為NAT檢測(cè)陽性。陽性的樣本委托羅氏公司做鑒別試驗(yàn)。

1.3.3 確認(rèn)試驗(yàn)HBV單試劑陽性的樣本進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)(中和試驗(yàn))，樣本的抑制率≥50%，判為陽性；HCV單試劑陽性的樣本進(jìn)行確證檢測(cè)(重組免疫印跡法RIBA)，至少出現(xiàn)2種HCV抗體特異條帶(Core、NS3、NS4、NS5)強(qiáng)度1+及以上判為陽性，僅出現(xiàn)1種HCV抗體特異條帶強(qiáng)度1+及以上判為不確定；HIV單試劑陽性的樣本進(jìn)行確證檢測(cè)(免疫印跡法WB)，至少有2條ENV帶(gp160/gp41和gp120)，或1條env帶和p24帶同時(shí)出現(xiàn)判為陽性，出現(xiàn)HIV抗體特異帶，但不足以判陽性的則判為不確定[3]。

2 結(jié)果

2.1 43473例樣本經(jīng)ELISA檢測(cè)有42161例陰性樣本和78例單試劑陽性樣本，其中HBV單試劑樣本45例，HCV單試劑樣本18例，HIV單試劑樣本15例。

2.2 核酸檢測(cè)42161例陰性樣本拆分后有75例陽性，經(jīng)鑒別試驗(yàn)有44例為HBV陽性，無HCV和HIV陽性；78例HBV、HCV、HIV單試劑陽性樣本，拆分后有7例陽性，經(jīng)鑒別試驗(yàn)有6例為HBV陽性，無HCV和HIV陽性。

2.3 78例單試劑陽性樣本NAT或確認(rèn)試驗(yàn)陽性判為陽性結(jié)果見表1。

表1 78份單試劑陽性結(jié)果

3 討論

42161例ELISA檢測(cè)陰性樣本，經(jīng)核酸檢測(cè)，檢出75例陽性樣本，陽性率為0.18%，高于德宏地區(qū)0.098%[4]和常州地區(qū)(0.1%)[5]，但低于龍巖地區(qū)0.24%[6]。45例HBV單試劑陽性樣本，核酸檢測(cè)7例陽性，18例HCV單試劑陽性樣本和15例HIV單試劑陽性樣本，核酸未檢出陽性。核酸檢測(cè)陽性樣本共82例經(jīng)核酸鑒別試驗(yàn)，有51例為HBV陽性，未檢出HCV和HIV陽性，陽性率為62.2%，與濟(jì)南地區(qū)63.86%[7]和東莞地區(qū)65.38%[8]相近。分析原因，可能是：(1)我國(guó)是HBV高流行國(guó)家，雖然HBV計(jì)劃免疫在我國(guó)取得了重大成效，但HBsAg在1~59歲普通人群中的流行率仍高達(dá)5.84%[9]，所以HBV的檢出率較高；(2)HBV是DNA病毒，對(duì)于外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，而HCV和HIV均是RNA病毒，對(duì)溫度較敏感，相對(duì)穩(wěn)定性差，易降解，造成HCV和HIV無法檢出；(3)在核酸檢測(cè)過程中由于擴(kuò)增產(chǎn)物、氣溶膠、人為操作等原因造成核酸檢測(cè)結(jié)果的假陽性；(4)由于我們樣本數(shù)量不夠大，所以未檢出HCV-RNA和HIV-RNA陽性的樣本。以上數(shù)據(jù)說明由于“窗口期”、靈敏度、亞型、病毒變異以及免疫靜默感染等方面原因，ELISA檢測(cè)存在局限性，NAT檢測(cè)能有效縮短病毒檢測(cè)窗口期，檢測(cè)隱匿性的病毒感染及病毒變異株等，彌補(bǔ)ELISA檢測(cè)的不足。

我們對(duì)HBV、HCV、HIV單試劑陽性樣本分別用中和、RIBA和WB試驗(yàn)確證。45例HBV單試劑陽性樣本有2例陽性，其中1例核酸檢測(cè)陽性；18例HCV單試劑陽性樣本有5例不確定，核酸未檢出；15例HIV單試劑陽性樣本有1例不確定，核酸未檢出，經(jīng)追蹤此樣本檢測(cè)結(jié)果同前，因此可以排除HIV陽性。結(jié)果表明，NAT試驗(yàn)雖能檢出部分ELISA漏檢的樣本，但由于檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度、樣本病毒載量低、病毒在樣本中的不規(guī)則分布和核酸檢測(cè)抓取病毒的隨機(jī)性等原因，有可能導(dǎo)致NAT檢測(cè)存在假陰性，所以NAT檢測(cè)不能完全代替ELISA檢測(cè)，同時(shí)核酸實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和精細(xì)化管理是十分重要的[10]。

綜上所述，筆者認(rèn)為開展NAT檢測(cè)十分必要，獻(xiàn)血者的HBV、HCV、HIV檢測(cè)模式選用一種ELISA試劑加一種NAT試劑檢測(cè)能最大限度地防止陽性樣本的漏檢，更好地保障血液安全，這與江西省血液中心的相關(guān)報(bào)道一致[11]。但任何的檢測(cè)試劑都存在靈敏度和特異性的問題，如何選擇最佳的ELISA試劑和NAT試劑的組合，將是我們下一步需要研究的。

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R193.3，R446.62，R512.91，R512.63，R512.62

A

1674-1129(2014)06-0778-02

2014-09-15；

2014-10-24)

江西省九江市科技局課題項(xiàng)目(編號(hào)∶[2013]50-19)