楊劍，劉劍榮，黃永建

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗科，江西萍鄉(xiāng)337055)

·實驗研究·

細菌培養(yǎng)法與核酸(熒光PCR法)檢測肺炎克雷伯菌的對比分析

楊劍，劉劍榮，黃永建

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗科，江西萍鄉(xiāng)337055)

目的探討培養(yǎng)及核酸檢測兩種不同方法進行肺炎克雷伯菌檢測分析的相關性，為臨床提供及時準確的結果。方法對本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標本，采用細菌培養(yǎng)法及核酸(熒光PCR法)檢測，結果進行對比統(tǒng)計分析。同時對熒光PCR法的特異性和敏感性進行研究。結果在68例痰標本中肺炎克雷伯菌檢出的結果，常規(guī)細菌培養(yǎng)法檢出陽性33例，陰性35例，陽性率48.53%；熒光PCR法檢出陽性49例，陰性19例，陽性率72.06%。對肺炎克雷伯菌標本DNA檢測得擴增產物，對非肺炎克雷伯菌無交叉反應，其檢測敏感性為1×103copies/ml。結論熒光PCR法檢出肺炎克雷伯菌的陽性率高于常規(guī)細菌培養(yǎng)法，具有很高的敏感性和特異性，檢測時間短，能為臨床診斷提供及時準確的結果。

肺炎克雷伯菌；細菌培養(yǎng)法；熒光PCR法

克雷伯菌屬為腸桿菌科中一類有莢膜的革蘭陰性桿菌，本屬中肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯桿菌和鼻硬結克雷伯菌與人類關系密切。其中肺炎克雷伯菌占克雷伯菌屬感染的95%以上。該菌存在于人類腸道、呼吸道以及水和谷物。當機體免疫力降低或長期大量使用抗生素導致菌群失調時，進入人體可引起肺炎、尿路感染、敗血癥、傷口感染、腦膜炎等多種疾病[1，2]。

近十來年發(fā)展的分子生物學技術，特別是聚合酶鏈反應(PCR)在臨床應用上越來越受到青睞，且不斷在推廣，使得臨床細菌感染后快速、準確診斷成為可能。本文對本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標本，通過細菌培養(yǎng)及核酸PCR檢測兩種不同方法對肺炎克雷伯菌進行檢測分析，比較兩種方法的相關性，同時對熒光PCR法的特異性和敏感性進行觀察，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標本密閉送檢，同一患者標本多次分離同樣細菌按一株算。

1.2 儀器和試劑VITEK32全自動細菌分析儀鑒定，鑒定卡由生物梅里埃公司提供。肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)由上海之江生物科技股份有限公司提供。本科室PCR實驗室已通過國家衛(wèi)生部驗收。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)細菌培養(yǎng)檢測肺炎克雷伯菌將送檢的痰標本分別接種于血平板、巧克力平板、中國蘭平板、TTC-沙氏。放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。巧克力平板置5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)18～24h后做進一步鑒定。并用標準株大腸埃希菌ATCC25922作為質控株[3]。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版操作[4]。

1.3.2 核酸檢測(熒光PCR法)嚴格按照肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)說明書進行操作。包括標本、對照品的核酸裂解處理，試劑配制，加樣，PCR擴增，閾值設定，質量控制，試驗結果計算。進行定量檢測時，陽性參考品(1×107copies/ml)進行10、100和1000倍梯度稀釋，試驗結束后，儀器自動生成標準曲線。

1.3.3 特異性試驗將培養(yǎng)為肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、化膿性鏈球菌、白念珠菌的痰標本分別用肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)進行DNA提取檢測。

1.3.4 敏感性試驗將肺炎克雷伯菌陽性參考品(1×107copies/ml)進行10倍梯度稀釋成：106copies/ ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml，然后進行DNA提取檢測[5]。

1.4 統(tǒng)計學方法分析兩種方法的陽性檢出率比較采用四格表資料的χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出情況在68例痰標本中肺炎克雷伯菌檢出的結果，常規(guī)細菌培養(yǎng)法檢出陽性33例，陰性35例，陽性率48.53%；熒光PCR法檢出陽性49例，陰性19例，陽性率72.06%。熒光PCR法檢出肺炎克雷伯菌的陽性率高于常規(guī)細菌培養(yǎng)法。未發(fā)現細菌培養(yǎng)陽性而熒光PCR法擴增陰性標本。見表1。

表1 兩種方法對68例痰標本檢測肺炎克雷伯菌陽性率比較

經統(tǒng)計學方法處理，χ2=3.93＞3.84=χ20.05(1)，P＜0.05，陽性檢出率的差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 特異性試驗培養(yǎng)為肺炎克雷伯菌的痰標本進行DNA提取后，PCR方法檢測得7.06× 106copies/ml；而非肺炎克雷伯菌的痰標本結果為低于檢測下限(＜500copies/ml)。表明熒光PCR法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗分別選取濃度為106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ ml、101copies/ml的標本進行DNA檢測，結果最低可檢出1×103copies/ml，與試劑說明書中產品性能指標的最低檢測限：1×103copies/ml相符。

3 討論

目前，肺炎克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫(yī)院感染病原菌之一，多見于年老體弱或原有慢性支氣管-肺疾患者，亦可通過機械呼吸器、霧化器或各種導管而感染，筆者采用細菌培養(yǎng)法和熒光PCR法對肺炎克雷伯菌進行檢測對比分析。結果表明，PCR檢測的陽性率高于常規(guī)細菌培養(yǎng)法，且經統(tǒng)計學分析，兩法有差異，具有統(tǒng)計學意義。同時結果表明熒光PCR法具有很高敏感性和特異性，與有關報道相符[6]。

培養(yǎng)法一直被認為是檢測細菌最可靠的方法，但該方法操作復雜、技術要求嚴格、費時；而細菌熒光定量PCR檢測技術具有很高的敏感性和特異性，不受細菌存活與否的限制，近年來廣泛應用臨床標本檢測,但該方法對實驗條件和檢查技術要求較高，又因敏感性較高，容易受外界污染的影響而產生假陽性[7]。本實驗中49例PCR陽性結果的標本，筆者認為不排除存在假陽性的可能。但未發(fā)現細菌培養(yǎng)陽性而熒光PCR法擴增陰性標本。然而，PCR檢測的陽性率明顯高于常規(guī)細菌培養(yǎng)法，分析原因可能還有：(1)采集標本細菌量少，加之雜菌生長迅速所覆蓋；(2)患者采樣前已使用過抗菌藥物，抗菌藥物抑制了細菌生長，導致培養(yǎng)結果陰性[5]。

肺炎克雷伯菌培養(yǎng)法一直是診斷克雷伯菌性肺炎的最可靠的方法，仍是目前主要的檢測手段。但細菌培養(yǎng)所需時間較長，對疾病的的診斷有一定的滯后。熒光PCR法核酸檢測具有不受病程影響、快速、敏感性和特異性高的優(yōu)點[8，9]，作為一項常規(guī)實驗室檢查發(fā)出報告只需要4h[10]，可以及時為臨床提供病原學的診斷結果。雖然PCR能較早檢出病原菌，但不能進行抗菌藥物的體外敏感試驗，其在臨床的應用還是受到一定的限制。加上PCR法要求在合格的PCR室進行，具有一定的局限性。但熒光PCR法是目前臨床上檢測克雷伯菌性肺炎的最佳方法之一，有條件的醫(yī)院可以開展。

[1]周正任,李凡.醫(yī)學微生物學[M].第6版.北京∶人民衛(wèi)生出版社, 2005∶181.

[2]張建敏,張衍勝.ICU病房產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌的感狀染況及耐藥分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(3)∶323-324.

[3]馬麗敏,廖致紅.重癥監(jiān)護室和普通病產房ESBL肺炎克雷伯菌的耐藥性對比[J].臨床醫(yī)學工程,2012,19(4)∶598-599.

[4]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].第3版.南京∶東南大學出版社,2008∶809.

[5]胡曉彥,桂炳東,王伶,等.BOX-PCR技術在肺炎鏈球菌檢測中應用[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010,28(3)∶209-211.

[6]王榮山,吳亦棟,高世強,等.實時熒光定量PCR檢測細菌方法的建立及其臨床應用[J].中華圍產醫(yī)學雜志,2005,8(4)∶142-245.

[7]胡周才,麗燕玲.熒光定量PCR法與培養(yǎng)法在檢測解脲支原體中的比較[J].現代診斷與治療,2011,22(2)∶107-108.

[8]屈玲,李芳芹,艾芳.肺炎支原體快速培養(yǎng)法在兒童呼吸道感染中的應用[J].延安大學學報∶醫(yī)學科學版,2009,7(3)∶121.

[9]Morozumi M,Ito A,Murayama S,et al.Assessmengt of real-time PCR for diagnosis of Mycoplasma pneumornia in pediatric patients[J]. Can J Microbiol,2006,52(2)∶125-129.

[10]張夢宇,鄭磊,溫淑娟,等.熒光定量PCR檢測侵襲性曲霉菌感染方法的建立[J].南方醫(yī)科大學學報,2007,27(5)∶731-733.

Comparison between bacterium culture and real-time PCR in detection of Klebsiella pneumoniae

YANG Jian,LIU Jianrong HUANG Yongjian.Department of Clinical Laboratory,Pingxiang People’s Hospital,Pingxiang Jiangxi 337005,China

Objective To compare the correlation of bacterium culture and real-time PCR for Klebsiella pneumoniae detection.Methods A total of 68 suspected-infection sputum samples were taken and analyzed by both bacterium culture and realtime PCR to detect Klebsiella pneumoniae.The sensitivity and specificity of real-time PCR were also analyzed.Results The detection rate of Klebsiella pneumoniae by real-time PCR was significantly higher than that by bacterium culture[72.06%(49/68)vs. 48.53%(33/68),P＜0.05].The sensitivity of real-time PCR was 1×103copies/ml and there were no cross reactions with Klebsiella pneumoniae.Conclusion The positive rate of real-time PCR was higher than bacterium culture.The high sensitivity and specificity and the rapid turnaround time make real-time PCR valuable for effective clinical diagnosis.

Klebsiella pneumoniae;Bacterium culture;Real-time PCR

R446.5,R446.62,R378.99+6

A

1674-1129(2014)06-0692-02DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.015

2014-08-25；

2014-09-17)

楊劍，女，1983年6月出生，學士學位，主管技師，研究方向為臨床免疫學和分子生物學檢驗。