金 飛（貴陽護理職業(yè)學(xué)院，貴陽 550081）

Rh血型和ABO血型是人類最重要的血型，主要分布于人類紅細(xì)胞表面，天然抗體為IgM類抗體，其中ABO血型關(guān)系到臨床的輸血安全、法醫(yī)鑒定等方面，其抗原決定簇為糖蛋白。A型個體主要基因為表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶A，其主要功能是將Gal－NAc從UDP－GalNAc分子上轉(zhuǎn)移到H前體糖蛋白上形成A抗原；B型個體表達(dá)，將Gal基團從UDP－Gal分子催化轉(zhuǎn)移到H前體糖蛋白上形成B抗原[1]。ABO基因的2個等位基因A101和B101編碼糖基轉(zhuǎn)移酶A和B。而在編碼區(qū)僅有7個核苷酸的差異，分別為297、526、657、703、796、803、930位，導(dǎo)致4個氨基酸殘基的不同，即176、235、266、268位。在常見的ABO血型的表型之外，在不同種族和人群之中，發(fā)現(xiàn)了很多因糖基轉(zhuǎn)移酶基因A和糖基轉(zhuǎn)移酶基因B低表達(dá)所致的ABO變異型。其中B血型的變異型包括5種，分別是B3、Bx、Bm、Bel和Bw。Bw亞型為弱B亞型。關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與血型變異的分子遺傳機制，國內(nèi)外也有報道[2－5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年在本院收集的一個漢族家系的2個姐妹，無近期輸血史，ABO血型鑒定時發(fā)現(xiàn)，正、反定型不符，隨即進行基因診斷，并對先證者進行家系調(diào)查；另取101例醫(yī)院體檢健康者，常見的ABO表型進行SNP的篩查。

1.2 常規(guī)血型血清學(xué)鑒定 進行常規(guī)ABO血型的正、反定型鑒定，姐妹和母親表現(xiàn)為單克隆抗－B側(cè)出現(xiàn)弱凝集，人源性抗－B側(cè)未出現(xiàn)凝集。姐妹血清中抗－B未見，母親血清中抗－B出現(xiàn)弱凝集。

1.3 標(biāo)本基因組DNA和總RNA提取 用蛋白酶K法提取家系中共4例的全血的基因組總DNA和用試劑盒法提取全血總RNA。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增條件 擴增反應(yīng)總體系為50μL，其中標(biāo)本DNA 3μL，正向引物2μL，反向引物2μL，超純水30μL，Taq酶2μL，dNTP 1μL，MgCl25μL，Taq酶Buffer 5μL。95℃預(yù)變性5min，95℃30s，62℃45s，72℃45s，28個循環(huán)，72℃延伸10min。

1.5 ABO基因擴增和PCR產(chǎn)物純化 ABO血型基因采用PCR技術(shù)進行擴增，采用Primer 5.0設(shè)計擴增引物[6]，擴增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒常規(guī)純化，送試劑公司測序。與B101基因比對，確定突變位點為B糖基轉(zhuǎn)移酶基因第721位C＞T的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈Arg241Trp的轉(zhuǎn)變。

1.6 ABO基因第721位C＞T變異頻率調(diào)查 取101例隨機無血緣關(guān)系標(biāo)本，以單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）的方法對ABO基因第6和7外顯子進行序列分析，對結(jié)果進行比對。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)檢查結(jié)果 2個先證者的父親顯示正常ABO血型血清學(xué)反應(yīng)，鑒定為B型；而母親和姐妹反應(yīng)鑒定為Bw亞型。見表1。

2.2 PCR產(chǎn)物直接序列分析 2個先證者及先證者父親、母親的基因組DNA經(jīng)過PCR測序后發(fā)現(xiàn)，父親的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)突變。但是2個先證者和母親B糖基轉(zhuǎn)移酶與GenBank AC000397正常序列經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)第721位C＞T的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶多肽鏈Arg241Trp的轉(zhuǎn)變。

2.3 SNP篩查 經(jīng)過101例SNP篩查，未發(fā)現(xiàn)在此位點的突變，說明此位點不是SNP位點。第7外顯子不存在第721位C＞T的轉(zhuǎn)變。經(jīng)過PCR－SSCP檢測，發(fā)現(xiàn)2個先證者和其父親均有特異性的條帶，說明721位點基因突變，但是在其余101例體檢標(biāo)本和父親的PCR產(chǎn)物中，未發(fā)現(xiàn)此特異性的條帶，隨機挑取10個標(biāo)本送測序公司測序，發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，證實SSCP的可靠性。說明721位點的等位基因頻率小于1／101，經(jīng)過檢索基因突變數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)此基因型為Bw03亞型。

表1 家系成員正反定型鑒定

圖1

3 討 論

自從發(fā)現(xiàn)ABO血型之后，人類對血型的抗原認(rèn)識飛速發(fā)展。ABO血型存在3個等位基因，分別是A、B和O型。A型由A糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼，B型由B糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼。酶樣蛋白質(zhì)的長度為354個氨基酸。該蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)移酶活性，能將相應(yīng)的基因連接到前提物質(zhì)H抗原之上，形成A和B抗原，進而形成4種血型。目前國際上，Olsson等[7]經(jīng)過篩查發(fā)現(xiàn)幾十例Bw亞型，其中大部分為B糖基轉(zhuǎn)移酶的變異，大多數(shù)為錯義突變導(dǎo)致的酶活性的降低和消失，其中十幾例瑞典人為721C＞T的突變；2005年Yazer等[8]進一步證實氨基酸變異（Met186val）能夠?qū)е碌腂w變異型。而在國內(nèi)，朱發(fā)明等[6]發(fā)現(xiàn)1例B糖基轉(zhuǎn)移酶基因第721位C＞T的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致B糖基轉(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域的改變[9]，進而導(dǎo)致其催化功能的減弱或者消失。本研究發(fā)現(xiàn)2例Bw亞型，且符合孟德爾遺傳定律，是母傳女的顯性遺傳形式。其中母親為C／T雜合，而2個女兒均為Bw／O雜合?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)十幾個與Bw亞型有關(guān)的B糖基轉(zhuǎn)移酶基因的突變[10－12]，其中大多數(shù)位于第7外顯子，包括Bw01～Bw11，這些突變導(dǎo)致的氨基酸的變異，主要集中在一段區(qū)域之中，而本研究發(fā)現(xiàn)的第721位點的突變屬于Bw03亞型，這說明Bw03亞型在中國人群中分布較廣，在臨床輸血時一定要注意此亞型，避免因為此亞型的存在，導(dǎo)致血型鑒定的錯誤，引起嚴(yán)重的輸血反應(yīng)。

值得注意的是，在作者大量收集A亞型或者B亞型的過程中，經(jīng)過PCR擴增，發(fā)現(xiàn)外顯子之間的內(nèi)含子存在多處SNP位點，但內(nèi)含子SNP位點是否會對糖基轉(zhuǎn)移酶活性產(chǎn)生影響，這種影響是提高糖基轉(zhuǎn)移酶活性，還是降低糖基轉(zhuǎn)移酶活性均未見報道。作者認(rèn)為，SNP位點的大量存在一定會影響其酶活性，導(dǎo)致A亞型或者B亞型。另外，作者也發(fā)現(xiàn)B糖基轉(zhuǎn)移酶的甲基化也很少有人報道，甲基化程度的改變也會影響轉(zhuǎn)錄的起始和酶的活性。作者認(rèn)為，B糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)含子SNP位點和甲基化程度將會是血型研究未來的方向，也將會成為各種亞型診斷的依據(jù)。

[1]許先國，洪小珍，劉瑛，等.一種新的B3變異型相關(guān)的B糖基轉(zhuǎn)移酶基因M142T突變研究[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2009，26（3）：254－257.

[2]Yamamoto F，McNeil PD，Yamamoto M，et al.Molecular genetic analysis of the ABO blood group system：1.Weak subgroup：A3and B3alleles[J].Vox Sang，1993，64（2）：116－119.

[3]Ogasawara K，Yabe R，Uchikawa M，et al.Recombination and gene conversion－like events may contribute to ABO gene diversity causing various phenotypes[J].Immunogenetics，2001，53（3）：190－199.

[4]Yu LC，Twu YC，Chou ML，et al.Molecular genetic analysis for the B（3）allele[J].Blood，2002，100（4）：1490－1492.

[5]Cho D，Kim SH，Ki CS，et al.A novel Bvar allele（547G＞A）demonstrates differential expression depending on the co－inherited ABO allele[J].Vox Sang，2004，87（3）：187－189.

[6]朱發(fā)明，許先國，洪小珍，等.α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因721C＞T突變導(dǎo)致Bw亞型[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22（2）：138－141.

[7]Olsson ML，Irshaid NM，Hosseini－Maaf B，et al.Genomic analysis of clinical samples with serologic ABO blood grouping discrepancies：identification of 15novel A and B subgroup alleles[J].Blood，2001，98（5）：1585－1593.

[8]Yazer MH，Denomme GA，Rose NL，et al.Amino－acid substitutionin the disordered loop of blood group B glycosyltransferase enzyme causes weak B phenotype[J].Transfusion，2005，45（7）：1178－1182.

[9]許先國，洪小珍，劉瑛，等.α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因新等位基因278C＞T的鑒定[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2006，23（6）：631－634.

[10]Seltsam A，Hallensleben M，Kollmann A，et al.The nature of diversity and diversification at the ABO locus[J].Blood，2003，102（8）：3035－3042.

[11]Estalote AC，Palatnik M，Chestery MA，et al.A novel blood group B subgroup：serological and genetic studies[J].Transfusion Med，2004，14（2）：173－180.

[12]喻瓊，吳國光，梁延連，等.一個中國漢族ABO血型亞型家系中發(fā)現(xiàn)新的B等位基因[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22（2）：129－133.