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        肺與大腸LPS信號(hào)通路相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

        2014-02-05 07:45:09劉曉燕郭霞珍
        世界中醫(yī)藥 2014年4期
        關(guān)鍵詞:空腸低氧大腸

        劉 絮 劉曉燕 郭霞珍

        (北京中醫(yī)藥大學(xué),北京,100029)

        肺與大腸LPS信號(hào)通路相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究

        劉 絮 劉曉燕 郭霞珍

        (北京中醫(yī)藥大學(xué),北京,100029)

        目的:研究肺與大腸LPS信號(hào)通路變化的相關(guān)性。方法:將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為生理組、高氧組、低氧組、限食組和限水組,通過測(cè)定肺與大腸中TLR4、MD2和CD14的變化觀察肺與大腸LPS信號(hào)通路的相關(guān)性。結(jié)果:高氧組和低氧組中肺部TLR4和MD2增高時(shí),腸部也有所增高(P<0.05),限食組和限水組中腸部TLR4和MD2增高時(shí),肺部亦有增高(P<0.05)。結(jié)論:可以認(rèn)為肺與大腸在LPS信號(hào)通路TLR4和MD2中有相關(guān)的協(xié)同識(shí)別。

        肺與大腸;LPS;TLR4;MD2;CD14

        細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的主要成分,也是免疫和炎癥反應(yīng)細(xì)胞的強(qiáng)大激活劑,是革蘭氏陰性細(xì)菌主要的致病成分,可刺激幾乎所有的真核細(xì)胞發(fā)生形態(tài)、代謝和基因表達(dá)變化,導(dǎo)致宿主細(xì)胞因子失控性表達(dá),介導(dǎo)嚴(yán)重感染,多臟器損傷,敗血癥休克等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。因此,LPS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已成為一個(gè)廣泛注意的研究領(lǐng)域,近年來已取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。

        本實(shí)驗(yàn)主要是研究肺與大腸LPS信號(hào)通路變化的相關(guān)性,肺與大腸是否具有相同的LPS的受體識(shí)別模式:ToU樣受體4(ToU Like Receptor,TLR4)、髓樣分化蛋白-2(Myeloid Differential Protein-2,MD2)和CD14協(xié)同識(shí)別。

        1 材料與方法

        1.1 材料 材料健康雌性SD大鼠,體重180~200 g,共50只,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。代謝籠式可變氧飼養(yǎng)箱,自主設(shè)計(jì),由凌云博際(北京)科技有限公司代為加工生產(chǎn)。測(cè)氧儀:數(shù)字式測(cè)氧儀,北京精微恒氧技術(shù)開發(fā)中心。天平:DT系列電子天平,北京天平物華醫(yī)療儀器有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)用氣體:40 L瓶裝氧氣與氣氣,北京朝紅平氣體有限公司提供。TLR4、MD2和CD14試劑盒由北京瑞格博科技發(fā)展有限公司提供。

        1.2 方法

        1.2.1 生理組大鼠模型 生理組大鼠不做任何處理,正常于代謝籠中喂養(yǎng)。7日后取材。

        1.2.2 高氧組大鼠模型 隨機(jī)選取9只雌性SD大鼠放置于可變氧詞養(yǎng)箱中喂養(yǎng),以10 L/min輸入氧氣,當(dāng)氧氣濃度達(dá)到40%后,持續(xù)輸入氮?dú)?~2 L/min使氧濃度維持在(40%±3)%,用數(shù)字式測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)箱內(nèi)氧濃度。每天給予8 h高氧刺激。溫度保持在25℃,濕度40%~60%,大鼠自由攝取食物和水。7日后取材。

        1.2.3 低氧組大鼠模型 隨機(jī)選取9只雌性SD大鼠置于可變氧飼養(yǎng)箱中,以10 L/min輸入氧氣,當(dāng)氧濃度達(dá)到10%后,持續(xù)輸入氮?dú)?~2 L/min,使氧濃度維持在(10%±1%),用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)箱內(nèi)氧濃度。每天給予8 h低氧刺激。溫度保持在25℃,濕度40%~60%,大鼠自由攝取食物和水。7日后取材。

        1.2.4 限食組大鼠模型 隨機(jī)選取9只雌性SD大鼠置于代謝籠中單籠飼養(yǎng),連續(xù)7天測(cè)量正常的進(jìn)食量和進(jìn)水量,之后按日平均進(jìn)食量的50%給予喂養(yǎng),飲水量不變。溫度保持在25℃,濕度40%~60%。7 d后取材。

        1.2.5 限水組大鼠模型 隨機(jī)選取9只雌性SD大鼠置于代謝籠中單籠飼養(yǎng),連續(xù)7天測(cè)量正常的進(jìn)食量和進(jìn)水量,之后按日平均進(jìn)水量的50%給予喂養(yǎng),進(jìn)食量不變。溫度保持在25℃,濕度40%~60%。7 d后取材。

        1.2.6 指標(biāo)測(cè)定 大鼠造模7日后取材,腹主動(dòng)脈取血后,迅速剪取肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織,生理鹽水洗滌后,置于液氮罐中,后放置于-40℃冰箱保存。TLR4、MD2和CD14均用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

        1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組間比較采用方差分析,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        (見表1、表2、表3)。

        2.1 生理現(xiàn)象 生理組和高氧組:大鼠在造模及取材過程中狀態(tài)良好,沒有顯著變化。低氧組:在造模過程中發(fā)現(xiàn)大鼠體重逐漸減輕,嗜睡,反應(yīng)遲鈍。限食組:在造模過程中大鼠身體逐漸消瘦,造模三四日后易激惹。限水組:取材時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸中糞便較多,便質(zhì)堅(jiān)硬。

        2.2 CD14 肺和回腸:與生理組比較,其他各組組織上CD14差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)??漳c:高氧組組織上CD14較生理組增高,其他各組均下降(P<0.05)。結(jié)腸:與生理組比較,其他各組組織上CD14均下降(P<0.05)??梢哉J(rèn)為肺與大腸CD14各組之間無比較意義。

        2.3 TLR4 回腸:與生理組比較,其他各組組織上TLR4差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)腸:限食組組織上TLR4較生理組降低(P<0.05),其他各組與生理組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)??漳c:與生理組比較,其他各組組織上TLR4均有增高(P<0.05),按其大小排序,限水組>高氧組>低氧組>限食組。肺:與生理組比較,其他各組組織上TLR4均有增高(P<0.05),按其大小排序,限水組>高氧組>限食組>低氧組。

        2.4 MD2 回腸:與生理組比較,其他各組組織上MD2差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)??漳c:與生理組比較,各組組織上MD2均有變化(P<0.05),除限水組其他各組均有增高。結(jié)腸:與生理組比較,各組組織上MD2均降低(P<0.05)。肺:與生理組比較,各組組織上MD2均有變化(P<0.05),除高氧組和低氧組之外其他各組均有增高。

        表1 各組大鼠肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織上CD14的變化(ng/mL,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用±s表示)

        表1 各組大鼠肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織上CD14的變化(ng/mL,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用±s表示)

        注:與生理組相比,*P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        組別例數(shù)肺空腸回腸結(jié)腸生理組9 38.59±2.78 3.31±0.64 15.17±5.10 26.72±4.01高氧組9 41.32±5.28 5.10±4.08*16.12±3.44 17.40±4.57*低氧組9 41.80±5.09 3.13±0.46*17.84±3.01 18.96±4.84*限食組9 41.01±3.57 3.12±0.78*13.03±6.06 21.36±5.45*限水組9 39.17±3.71 3.12±0.78*16.31±1.86 18.97±6.08*

        表2 各組大鼠肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織上TLR4的變化(ng/mL,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用±s表示)

        表2 各組大鼠肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織上TLR4的變化(ng/mL,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用±s表示)

        注:與生理組相比,*P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        組別例數(shù)肺空腸回腸結(jié)腸生理組9 2.06±0.13 0.16±0.030.87±0.26 1.03±0.15高氧組9 2.23±0.24*0.27±0.20*1.02±0.23 0.84±0.19低氧組9 2.08±0.16*0.18±0.04*1.00±0.33 0.93±0.14限食組9 2.19±0.19*0.17±0.18*0.77±0.35 0.93±0.17*限水組9 2.29±0.16*0.97±0.22*1.05±0.21 0.97±0.22

        表3 各組大鼠肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織上MD2的變化(ng/mL,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用±s表示)

        表3 各組大鼠肺、空腸、回腸、結(jié)腸組織上MD2的變化(ng/mL,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用±s表示)

        注:與生理組相比,*P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        組別例數(shù)肺空腸回腸結(jié)腸生理組9 2.28±0.41 0.13±0.04 0.60±0.25 1.04±0.18高氧組9 2.23±0.19*0.21±0.13*0.85±0.30 0.60±0.14*低氧組9 2.20±0.33*0.15±0.03*0.77±0.29 0.67±0.15*限食組9 2.47±0.21*0.14±0.04*0.61±0.52 0.59±0.22*限水組9 2.70±0.15*0.10±0.05*0.77±0.26 0.77±0.27*

        3 討論

        LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路:脂多糖結(jié)合蛋白(LPSBinding Protein,LBP)將LPS傳遞給CD14分子,由CD14介導(dǎo)LPS細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)而使NF-κB激活,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子TNF、白介素、黏附分子等的表達(dá)。LPS與血清中sCD14結(jié)合,再與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。CD14與多種傳遞信號(hào)的跨膜信號(hào)受體不同,CD14分子缺乏胞漿區(qū)段,因此CD14不能直接和細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行信號(hào)交流,尚需其他分子起信號(hào)傳導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體是LPS信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的門戶蛋白。作為L(zhǎng)PS的低親和力受體的TLR4可以轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激信號(hào)。二者結(jié)合即可形成具備高親和力結(jié)合和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的受體復(fù)合體,將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)[2]。而MD2是協(xié)助TLR4完成LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的必不可少的因素。研究[3]發(fā)現(xiàn)MD2不僅能增強(qiáng)TLR4對(duì)LPS的反應(yīng)性,還能拓寬TLR4對(duì)LPS結(jié)構(gòu)的識(shí)別范圍。MD2可能幫助TLR4識(shí)別LPS/LBP/CD14復(fù)合物,并將LPS鎖定在結(jié)合位點(diǎn)上[4]。MD2在TLR4介導(dǎo)的LPS信號(hào)通路中具有重要作用。

        TLR4在細(xì)胞表面與MD2及CD14協(xié)同,形成TLR4/MD2/CD14聚合體,共同識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)、內(nèi)源性配體如熱休克蛋白(Hsp60、Hsp70)等配體,將其信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi),引起下游信號(hào)途徑的激活[5]。

        在本實(shí)驗(yàn)中,通過數(shù)據(jù)分析可以知道肺病模型中肺部TLR4和MD2增高時(shí),腸部也有所增高,腸病模型中腸部TLR4和MD2增高時(shí),肺部亦有增高。TLR4和MD2的表達(dá)在肺與大腸之間是呈正相關(guān)關(guān)系的,表明肺與大腸在炎癥形成及防治中存在緊密的內(nèi)在聯(lián)系??梢哉J(rèn)為肺與大腸在LPS信號(hào)通路是有相關(guān)性的,在TLR4和MD2有相關(guān)的協(xié)同識(shí)別,可以為臨床實(shí)踐提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

        [1]楊一新,李桂源.LPS所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2006,31(1):141.

        [2]胡承香,楊清武,呂鳳林,等.CD14與TLR4相互作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,26(10):882.

        [3]李永旺,麻莉.內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TLR4-MD2信號(hào)傳導(dǎo)通路[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2002,18(2):121.

        [4]鐘田雨,劉靖華,蔣勇.髓樣分化蛋白-2在識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)毒素信號(hào)中的作用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2007,34(5):460-464.

        [5]Cararnalhol,Lopes-CarvalhoT,OstlerD,etal.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide[J]. JExp Med,2003,197(4):403-411.

        (2014-03-11收稿 責(zé)任編輯:洪志強(qiáng))

        The Experiment al Study on LPS Signal Path Correlation of Lung and Large Intestine

        Liu Xu,Liu Xiaoyan,Guo Xiazhen
        (Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

        Objective:To study LPSsignal path changesof lung and large intestine.Methods:Micewere random ly divided into physiological group,hyperoxia group,hypoxia group,diet restriction group,water restriction group.The LPS signal path's correlation of lung and large intestine was observed detecting changes of variation of TLR4,MD2 and CD14 in lung and large intestine.Results:When TLR4 and MD2 in the lungs of hyperoxiagroup and hypoxia group increased,they also increased in the large intestines.When TLR4 and MD2 in the large intestines of diet restriction group and water restriction group increased,they also increased in the lungs.Conclusion:Lung and large intestine can be thought to have related synergy identification in TLR4 and MD2 of LPS signal path.

        Lung and large intestine;LPS;TLR4;MD2;CD14

        R221;R256.1;R332

        A

        10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.007

        國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào):2009CB522706)

        劉絮(1989—),女,山東濟(jì)寧人,在讀碩士研究生,中醫(yī)基礎(chǔ)理論。E-mail:liuxu039@sina.com

        郭霞珍(1950—),女,浙江杭州人,教授,主任醫(yī)師,研究方向:四時(shí)五臟陰陽

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