喻 云 許 強 郭乃洲 (鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院衛(wèi)生所，鹽城224005)

Mina和IL-4基因的交互作用與兒童哮喘的相關(guān)性研究

喻 云 許 強①郭乃洲②(鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院衛(wèi)生所，鹽城224005)

目的:研究Mina基因rs4857304(G/T)位點和IL-4基因位點rs2243248(T/G)、rs2070874(T/C)單核苷酸多態(tài)性與我國漢族兒童過敏性哮喘發(fā)病的相關(guān)性，并進一步分析3個位點之間的交互作用。方法:采用病例對照研究方法，分析不同等位基因頻率和基因型在哮喘患者和對照組患者中的分布差異，及其交互作用。結(jié)果:將兩組患者Mina的rs4857304位點進行比較，哮喘組患者的位點等位基因T頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，OR=1.773，95%CI=1.256～2.503);而兩組的基因型分布則無顯著差異(P＞0.05);交互作用的MDR分析顯示，Mina基因位點rs4857304和IL-4基因位點rs2243248構(gòu)成的2個位點最佳模型;Mina位點rs4857304和IL-4基因位點rs2070874和rs2243248構(gòu)成的3個位點最佳模型。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:過敏性哮喘與Mina位點rs4857304具有相關(guān)性，同時Mina rs4857304與IL-4位點rs2243248、rs2070804具有顯著的交互作用。

基因;交互作用;哮喘

哮喘是一種多基因疾病，它的發(fā)病機制與環(huán)境因素有著密切的關(guān)系，而Th2細胞的偏移是引起過敏性哮喘的主要因素之一[1]。對Th2路徑調(diào)控機制基因位點及基因位點之間交互作用進行深入研究具有重要的意義。目前臨床上對IL-4及其受體基因等易感基因也進行了廣泛研究[2]。有實驗表明，SNPs可參與調(diào)節(jié)實驗動物模型中IL-4的表達水平[3，4]，我們猜測 SNPs 可能與哮喘、寄生蟲感染等因Th2偏移而引發(fā)的相關(guān)疾病有著重要的聯(lián)系，但目前仍未有明確報道來證明Mina基因位點的SNPs與人類過敏性哮喘的發(fā)病有關(guān)。

本研究選取位于5′UTR區(qū)域的第1個內(nèi)含子的Mina基因rs4857304(G/T)進行研究，進一步分析其與中國漢族兒童過敏性哮喘發(fā)病的相關(guān)性。同時，本研究還選取了目前研究較多的IL-4基因多態(tài)位點中的兩個:rs2070874(T/C)和 rs2243248(T/ G)，以分析基因之間的交互作用在哮喘發(fā)病中的地位。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在征得患兒家長同意的前提下，選取2010年1月～2011年1月在我院就診的哮喘病患兒186例作為研究對象，年齡分布在3～12歲，所有患兒均接受皮膚點刺試驗，證實過敏原陽性至少有1項。另選取同期因外傷在我院接受治療的186例無過敏性疾病史及一級親屬無過敏性疾病家族史的漢族兒童為對照組。

1.2 方法

1.2.1 提取 DNA 用 Qiagen(Germany，DP430) DNA提取試劑盒，根據(jù)說明書采集2 ml枸櫞酸鈉抗凝外周靜脈血保存于-20℃冰箱中。

1.2.2 基因分型 用 Assay Designer(Sequenom)軟件包設(shè)計單堿基延伸引物和PCR引物(見表1)。用Mass ARRAY(America，Sequenom)系統(tǒng)進行SNP分型。

PCR 反應(yīng)條件:94℃ 15 min，94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共 43 個循環(huán);最終 72℃ 3 min。SNP單堿基延伸反應(yīng)條件:94℃30 s，94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，共38個循環(huán);最后72℃ 3 min。

1.2.3 血清IgE檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測(試劑購自美國的Bio Check公司)，＞150 U/ml呈陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 Hardy-Weinberg平衡檢驗每組位點，以P＞0.0001為標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。哮喘組和對照組的基因型頻率和等位基因采用χ2檢驗。SNP間的交互作用采用Multifactoe dimensionality reduction(MDR)2.0軟件進行分析。MDR檢驗原理是在多個環(huán)境或基因因素中篩選出最能預(yù)測表型的因素建立最佳模型。其主要衡量指標(biāo)包括:交叉驗證一致性和預(yù)測準(zhǔn)確性。交叉驗證一致性愈高，則預(yù)測的準(zhǔn)確性愈高。

表1 IL-4和Mina基因多態(tài)位點PCR引物和單堿基延伸引物序列Tab.1 Sequence of PCR primer and single base extension primer for gene polymorphic locus of IL-4 and Mina

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的臨床資料比較 哮喘組患者的血清IGE水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.2 IL-4和Mina與哮喘的關(guān)系 經(jīng)檢驗，所有位點均符合Hardy-Weinberg平衡定律。比較兩組Mina rs4857304位點等位基因頻率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

表2 兩組患者的臨床資料比較Tab.2 Comparison on clinical data between groups

表3 兩組患者IL-4和Mina位點等位基因頻率和基因型分布比較Tab.3 Comparison on Genotype and allele frequency of IL-4 and Mina between groups

表4 Mina和IL-4位點間交互作用的MDR分析最佳模型Tab.4 MDR analysis model of interaction between IL-4 and Mina

2.3 MDR分析SNP位點間的交互作用 經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，IL-4 rs2070874，rs2243248，Mina rs4857304，不僅三者之間存在著相互作用，而且每兩者之間也有相互聯(lián)系。以 IL-4rs2070874，rs2243248和 Mina rs4857304為三個位點的最佳模型。兩個位點的最佳模型僅包含Mina基因位點rs4857304和IL-4基因位點中的rs2243248。兩組患者三個位點和兩個位點的最佳模型均具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確性及交叉一致驗證性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

3 討論

支氣管哮喘是一種最常見的慢性疾病，多在兒童期發(fā)病，約30%～50%的兒童患者病情會延至成年。據(jù)統(tǒng)計美國約有440萬哮喘患兒[5]，有10.9%的在校高中生患有哮喘[6]。我國0～14歲兒童哮喘的發(fā)病率從1990年的0.11% ～2.03%上升到2000年的0.25% ～4.63%[7]。哮喘反復(fù)發(fā)作會嚴重影響人們的正常生活、工作和學(xué)習(xí)，導(dǎo)致兒童生長發(fā)育障礙，并會逐漸演變成慢性阻塞性肺病或肺心病。長期以來，人們按照抗原分化和功能特征將CD4+T細胞分為輔助性T細胞1型(T helper cell 1，Th1)、2 型(Th2)，前者偏向分泌 IL-2、IFN-α、TNF-α 等Ⅰ型細胞因子，稱為Th1型細胞因子;而Th2細胞偏向分泌IL-4、IL-5、IL-6等Ⅱ型細胞因子，稱為Th2細胞因子?，F(xiàn)有研究證實，哮喘的發(fā)生源于特異性Th細胞的分化發(fā)生偏移，最終導(dǎo)致體內(nèi)Th1和Th2反應(yīng)失衡，表現(xiàn)為以Th2反應(yīng)為主[8]。

IL-4是Th2型細胞因子，其在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是本次研究結(jié)果顯示IL-4基因多態(tài)性與變態(tài)反應(yīng)性哮喘不相關(guān)。我們認為環(huán)境和種族因素可能影響了研究結(jié)果出現(xiàn)差異，但這一結(jié)果與此前報道的rs2070874與哮喘發(fā)病不相關(guān)一致[9，10]。

本研究中，哮喘組Mina rs4857304位點等位基因T頻率高于對照組，我們推測兒童哮喘的發(fā)病與Mina有相關(guān)性。通過驗證血清IL-4水平表達與Mina基因型之間的關(guān)系可知Mina在哮喘病的發(fā)病機制中發(fā)揮著作用，但這一觀點還有待更多的研究來證實[11，12]。

本研究中，IL-4基因位點 rs2070874和rs2243248在兩組患者中分布無顯著差異，但經(jīng)MDR分析顯示，IL-4位點 rs2070874，rs2243248與Mina rs4857304之間有明顯的交互作用，我們認為這三個位點在哮喘病的發(fā)病機制中可能具有相互作用。

由于哮喘病的基因表型相對復(fù)雜，故研究多位點、多基因之間的關(guān)系變得更加重要。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病機制和 Mina基因位點rs4857304具有相關(guān)性，且Mina rs4857304與IL-4位點rs2070874、rs2243248之間具有顯著的交互作用，說明基因間的相互作用及基因與環(huán)境因素關(guān)系的深入研究對哮喘疾病的發(fā)病及預(yù)后具有重要的臨床意義。

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[收稿2013-09-20 修回 2013-11-18]

(編輯 倪 鵬)

Interaction of Mina and IL-4 gene and their relevance to asthma children

YU Yun，XU Qiang，GUO Nai-Zhou.Yancheng Institute of Industry Technology，Yancheng 224005，China

Objective:To study the relevance of Mina rs4857304(G/T)gene locus，IL-4 gene locus rs2243248(T/G)，rs2070874(T/C)single nucleotide polymorphism and allergic asthma pathogenesis of Chinese children，and further analysis of the interaction among three loci.MethodsBased on the case-control study，we have analyzed the different distributions，frequencies，interaction of alleles and genotypes between asthma patients and patients in control group.ResultsThe Mina rs4857304 sites of patients were compared，and there was statistically significant difference between two groups(P=0.001，OR=1.773，95%CI=1.256-2.503);the rs4857304T allelic frequency of patients with asthma was higher than that of the patients in control group，but there was no statistically significant difference about the distribution of different locus genotypes of patients between two groups(P ＞0.05);MDR interaction analysis have showed that Mina gene loci，rs4857304 and IL-4loci rs2243248，consisting of 2 sites optimal model;Mina loci rs4857304，IL-4loci rs2070874 and rs2243248 that consisting of 3 sites optimal model.There was statistically significant difference between two groups(P ＜ 0.05).ConclusionAllergic asthma would be associated with Mina loci rs4857304，while there might be significant interactive effects among Mina rs4857304，IL-4loci rs2243248 and rs2070804.

Gene;Interaction;Asthma

R256.12

A

1000-484X(2014)05-0684-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.026

①鹽城市第一人民醫(yī)院兒科，鹽城224001。

②鹽城市第一人民醫(yī)院體檢中心，鹽城224005。

喻 云(1964年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事全科醫(yī)學(xué)方面研究，E-mail:ycfyyuyun@163.com。

·教學(xué)園地·