王 旎 董超然 唐 萃 楊 磊 劉智敏 (重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其意義①

王 旎 董超然 唐 萃 楊 磊 劉智敏 (重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

目的:探討HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其意義。方法:采用免疫組化SP法檢測(cè)70例人甲狀腺乳頭狀癌組織和40例正常甲狀腺組織中HIF-1α、HIF-2α和MT的表達(dá)水平，并分析這三種蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性及三者間的表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果:在70例人甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIF-1α、HIF-2α和MT的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.86%(37/70)、50.00%(35/70)和 44.29%(31/70)。HIF-1α、HIF-2α 和 MT 的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P=0.034，P=0.022，P=0.032)。此外，HIF-1α 與 HIF-2α 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.258，P=0.031)，HIF-1α 與 MT 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.266，P=0.026)，HIF-2α 與 MT的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.259，P=0.030)。兩種蛋白(HIF-1α/ HIF-2α，HIF-1α/MT，HIF-2α/MT)聯(lián)合表達(dá)較一種蛋白表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更具相關(guān)性(HIF-1α/HIF-2α:P=0.004，HIF-1α/MT:P=0.024，HIF-2α/MT:P=0.029)。HIF-1α、HIF-2α和MT三種蛋白聯(lián)合表達(dá)較兩種或一種蛋白表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更具有相關(guān)性(P=0.017)。結(jié)論:HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且三者的表達(dá)密切相關(guān)，HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況可作為監(jiān)測(cè)甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

甲狀腺乳頭狀癌;HIF-1α;HIF-2α;MT

低氧是實(shí)體腫瘤常見的一種微環(huán)境，并在腫瘤進(jìn)展的不同階段發(fā)揮核心作用[1]。腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧的反應(yīng)主要是由低氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)調(diào)節(jié)的。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基構(gòu)成的，其中HIF-1β是組成性表達(dá)，而HIF-1發(fā)揮作用主要是由HIF-1α亞基的活性決定的。HIF-2α與HIF-1α具有高度的同源性，它們主要激活參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的基因。金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)是一類富含半胱氨酸的非酶類金屬結(jié)合蛋白質(zhì)家族，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1%～2%，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的一種類型。目前，有關(guān)HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性研究報(bào)道甚少，本實(shí)驗(yàn)通過采用免疫組化SP法檢測(cè)70例人甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本和40例正常甲狀腺組織中 HIF-1α、HIF-2α和MT的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料分析它們與臨床病理因素的關(guān)系及三者表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)而探討HIF-1α、HIF-2α和MT能否作為監(jiān)測(cè)甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院外科2010年1月～2011年10月手術(shù)后經(jīng)病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌的組織標(biāo)本共70例和癌旁正常甲狀腺組織共40例。依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標(biāo)準(zhǔn):其中，Ⅰ期30例，Ⅱ期12例，Ⅲ期28例，Ⅳ期0例;23人無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，47人有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;男性14人，女性56人;患者年齡13～79歲，平均年齡41歲。腫瘤平均直徑為 2.4 cm(0.3～6.0 cm)。

1.2 主要試劑 兔抗人HIF-1α多克隆抗體為Bioworld公司產(chǎn)品。兔抗人HIF-2α多克隆抗體和鼠抗人MT單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品。兔抗人IgG多克隆抗體為Millipore公司產(chǎn)品。免疫組化SP法試劑盒和DAB試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用鏈霉親和素-過氧化物酶法(Streptavidin-Perosidase，SP)。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋及4 μm連續(xù)切片，切片分別作HE染色與免疫組化染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟2 h，梯度酒精水化。熱修復(fù)后滴加3%過氧化氫，室溫30 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min。10%山羊血清孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加1∶50稀釋的兔抗人HIF-1α和兔抗人 HIF-2α多克隆抗體(Bioworld Technology，USA)和1∶100稀釋的鼠抗人MT單克隆抗體(Abcam，USA)稀釋液，于4℃過夜。室溫復(fù)溫30 min后，PBS洗3次。滴加生物素化山羊抗兔二抗和生物素化山羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次。滴加過氧化物酶-鏈霉親和素復(fù)合物(streptavidin-HRP)，室溫孵育30 min，PBS洗3次。加入氫化二氨基聯(lián)苯胺過氧化物酶(DAB)顯色液，光學(xué)顯微鏡下控制顯色，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用兔抗人IgG多克隆抗體替代一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化染色半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比。強(qiáng)度分為0(未染色)、1(弱染色)、2(中度染色)和3(強(qiáng)染色)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比0(＜5%陽(yáng)性細(xì)胞)、1(6% ～25%陽(yáng)性細(xì)胞)、2(26% ～50%陽(yáng)性細(xì)胞)、3(51% ～75%陽(yáng)性細(xì)胞)和4(＞75%陽(yáng)性細(xì)胞)。將強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比得分相乘得到最終的染色評(píng)分:0(未染色)、+(1～4)、++(5～8)和 +++(9～12)。0或+為陰性組，++或+++為陽(yáng)性組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、HIF-2α 和 MT 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性 在40例正常甲狀腺組織中，HIF-1α、HIF-2α和 MT陽(yáng)性表達(dá)率均為0，組織中極少量染色細(xì)胞(如圖1A、B、C)。在70例甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIF-1α、HIF-2α和 MT陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.86%(37/70)、50.00%(35/70)和44.29%(31/70)，三者在胞漿和胞核均有表達(dá)(如圖1D、G，E、H，F(xiàn)、I)。經(jīng) Spearman等級(jí)相關(guān)分析，由表1可知，HIF-1α、HIF-2α和MT的陽(yáng)性表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與此同時(shí)，HIF-1α、HIF-2α和MT的陽(yáng)性表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小及TNM分期無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

圖1 HIF-1α、HIF-2α和MT在正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)(SP法，×400)Fig.1 Expression of HIF-1α，HIF-2α and MT in normal thyroid tissues and papillary thyroid carcinoma tissues(SP method，×400)

表1 HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation of HIF-1α，HIF-2α and MT expression with clinicopathological characteristics in papillary thyroid carcinoma

表2 HIF-1α、HIF-2α和MT在人甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)的相關(guān)性Tab.2 Correlation of HIF-1α，HIF-2α and MT protein expression with one another in 129 PTCs

2.2 HIF-1α、HIF-2α 和 MT 在人甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，由表2可知，在70例甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本中，HIF-1α與 HIF-2α蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs= 0.258，P=0.031)，HIF-1α 與 MT蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.266，P=0.026)，HIF-2α 與 MT 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.259，P=0.030)。

2.3 人甲狀腺乳頭狀癌組織中HIF-1α、HIF-2α和MT聯(lián)合表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 由于HIF-1α、HIF-2α和MT兩兩蛋白分子間的表達(dá)具有正相關(guān)性，而統(tǒng)計(jì)分析表明，HIF-1α、HIF-2α和MT表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，我們進(jìn)一步分析 HIF-1α/HIF-2α、HIF-1α/MT 和 HIF-2α/MT兩種分子同時(shí)表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。如表3所示，HIF-1α/HIF-2α兩種分子同時(shí)表達(dá)的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率(91.30%)比僅有其中一種分子表達(dá)的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率(53.85%)高，類似的結(jié)果還見于 HIF-1α/MT和HIF-2α/MT的分子表達(dá)中。HIF-1α/HIF-2α、HIF-1α/MT和HIF-2α/MT兩種分子同時(shí)表達(dá)較僅有其中一種分子表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有更為顯著的相關(guān)性(HIF-1α/HIF-2α:P=0.004，HIF-1α/MT: P=0.024，HIF-2α/MT:P=0.029)。此外，統(tǒng)計(jì)分析表明三種分子同時(shí)表達(dá)較兩種分子或僅有其中一種分子表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有更為顯著的相關(guān)性(P=0.017)。

表3 人甲狀腺乳頭狀癌組織中HIF-1α、HIF-2α和MT聯(lián)合表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性Tab.3 Correlation of concomitant expression of HIF-1α，HIF-2α and MT with cervical lymph node metastasis

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌約占甲狀腺惡性腫瘤的80%，其特點(diǎn)是生長(zhǎng)緩慢，預(yù)后良好。然而，在某些患者中早期就表現(xiàn)出頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這往往是導(dǎo)致其不良預(yù)后和死亡的主要原因。雖然頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并不直接影響甲狀腺乳頭狀癌患者的生存率，但它會(huì)增加腫瘤局部復(fù)發(fā)率和再次手術(shù)的機(jī)會(huì)。國(guó)外研究者認(rèn)為，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者是無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者復(fù)發(fā)率和死亡率的30倍[2]。因此，甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期診斷，對(duì)指導(dǎo)制定治療方案以提高臨床診治水平具有重要意義。

實(shí)體腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中普遍處于低氧微環(huán)境中，并對(duì)缺氧做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下，HIF-1α與HIF-2α的穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子HIF-1與HIF-2活性增高，進(jìn)而促進(jìn)血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[3]，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。MT作為HIF-1的靶基因之一，HIF-1激活可誘導(dǎo)MT表達(dá)上調(diào)，而MT的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞過度增生有關(guān)[4];另一方面，MT表達(dá)上調(diào)可增加HIF-1的穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性[5]，兩者表現(xiàn)出相互促進(jìn)作用。HIF-2α與HIF-1α結(jié)構(gòu)相似，推測(cè)兩者也可能存在相互促進(jìn)作用。研究表明，HIF-1α在卵巢癌、食管癌和頭頸部癌組織中高表達(dá)[6-8];HIF-2α在腎透明細(xì)胞癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)[9，10];MT 在腎、肺、乳腺、前列腺、睪丸、卵巢、膀胱、宮頸、子宮內(nèi)膜等多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)增加[11，12]。這三種分子在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)與腫瘤病人的不良預(yù)后相關(guān)[6-12]。

本研究通過檢測(cè)70例甲狀腺乳頭狀癌組織中HIF-1α、HIF-2α和MT的表達(dá)情況，三種蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05)。在70例甲狀腺乳頭狀癌組織中，HIF-1α、HIF-2α和MT的過表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小及TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性，而與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P＜0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析提示:HIF-1α與HIF-2α、HIF-1α與MT以及HIF-2α與MT的表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，這表明HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展過程可能具有相互協(xié)同作用。

鑒于HIF-1α、HIF-2α和MT的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且三種蛋白兩兩間存在正相關(guān)性。本研究對(duì)HIF-1α、HIF-2α和MT兩兩陽(yáng)性表達(dá)是否與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示:HIF-1α與 HIF-2α、HIF-1α與 MT、HIF-2α與MT兩種蛋白同時(shí)表達(dá)較僅有其中一種分子表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有更為顯著的相關(guān)性。三種分子同時(shí)表達(dá)較兩種分子或僅有其中一種分子表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)具有更為顯著的相關(guān)性。通過本實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌中腫瘤低氧微環(huán)境可通過激活HIF-1α與HIF-2α上調(diào)MT的表達(dá);另一方面，MT可以增加HIF-1α與HIF-2α的穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)HIF-1和HIF-2的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過本次實(shí)驗(yàn)，可初步認(rèn)為HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況可作為監(jiān)測(cè)其發(fā)展的指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)HIF-1α、HIF-2α和MT在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)，可為臨床早期診斷發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供生物學(xué)指標(biāo)。

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[收稿2013-10-02 修回2013-12-09]

(編輯 許四平)

Expression and significance of HIF-1α，HIF-2α and MT in human papillary thyroid carcinoma

WANG Ni，DONG Chao-Ran，TANG Cui，YANG Lei，LIU Zhi-Min.Molecular Medicine and Cancer Research Center，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Objective:To investigate the expression of HIF-1α，HIF-2α and MT in human papillary thyroid carcinoma(PTC) and the association of their expression with clinicopathological indicators.MethodsImmunohistochemistry was used to analyze the expression of HIF-1α，HIF-2α and MT in 70 PTC samples.The correlations of HIF-1α，HIF-2α and MT expression with one another，and with several clinicopathological indicators were statistically analyzed.ResultsIn 70 PTC samples，the positive expression rates of HIF-1α，HIF-2α and MT were 52.86%(37/70)，50.00%(35/70)and 44.29%(31/70)，respectively.HIF-1α，HIF-2α and MT expression had significant correlations with cervical lymph node metastasis(P=0.034，P=0.022，and P=0.032，respectively).Meanwhile，HIF-1α expression had a positive correlation with HIF-2α (rs=0.258，P=0.031)and MT(rs=0.266，P=0.026).HIF-2α and MT expression were positively correlated(rs=0.259，P=0.030).Concomitant expression of any two or all of the three molecules had stronger correlation with lymph node metastasis than did each alone(P=0.004 for HIF-1α/HIF-2α，P=0.024 for HIF-1α/MT，P=0.029 for HIF-2α/MT，P=0.017 for HIF-1α/HIF-2α/MT).ConclusionHIF-1α，HIF-2α and MT expression in PTC samples have a closely correlation，which are related to cervical lymph node metastasis.Therefore，the expression of HIF-1α，HIF-2α and MT might be used as biomarkers for cervical lymph node metastasis of PTC.

Papillary thyroid carcinoma;HIF-1α;HIF-2α;MT

R736.1

A

1000-484X(2014)05-0662-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.020

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81072183)、重慶市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(CSTC，2011BA5038)、國(guó)家留學(xué)人員科技活動(dòng)啟動(dòng)項(xiàng)目(渝人社辦，2011.235號(hào))和重慶醫(yī)科大學(xué)重點(diǎn)科研課題(XBZD201002)資助。

王 旎(1987年－)，女，主要從事乳頭狀甲狀腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，E-mail:cqwangni@qq.com。

及指導(dǎo)教師:劉智敏(1962年－)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事甲狀腺癌方面的研究，E-mail:liuzm9999@aliyun.com。

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