孫保國(guó)，項(xiàng)婷，李玉龍，陳澤雄

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510080)

長(zhǎng)期以來(lái)脾虛模型的制備都是一個(gè)難點(diǎn)。本質(zhì)上來(lái)講，關(guān)于脾虛模型的制備理論出發(fā)點(diǎn)有兩個(gè)，一個(gè)是病因出發(fā)點(diǎn)，一個(gè)是癥狀出發(fā)點(diǎn)。前者主要強(qiáng)調(diào)模型在病因病機(jī)上與臨床脾虛的一致性，如飲食饑飽過(guò)度，偏食寒涼、肥膩，勞累過(guò)度，思慮過(guò)度，睡眠剝奪等;后者主要強(qiáng)調(diào)模型癥狀與臨床脾虛的一致性，如倦怠、懶言、精神不振、失眠、納差、腹瀉便溏、出血、水腫、腹水等，經(jīng)典的造模方法是利血平副作用法。脾虛是中醫(yī)認(rèn)識(shí)人體體質(zhì)和證的一個(gè)綜合表現(xiàn)，脾虛證的病因千差萬(wàn)別，而臨床癥狀卻多具有一致性，研究中應(yīng)該根據(jù)不同的疾病選擇合理的造模方法。本研究針對(duì)肝癌的一般病因:外感濕濁，脾胃內(nèi)傷，阻滯氣機(jī)，肝氣郁結(jié)，痰瘀毒結(jié)，制作模型過(guò)程中突出濕濁外受、飲食饑飽過(guò)度及寒涼勞力傷中的原則制備脾虛模型;并在此基礎(chǔ)上采用原位移植方法將瘀血痰毒植入肝臟，形成脾虛肝癌模型;盡量在病因和病理上模擬肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，做到合情合理。并探索了苦寒藥物大承氣湯和小承氣湯在模型中的差別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

中藥材購(gòu)自廣州市藥材公司，基源鑒定符合2010年《中華人民共和國(guó)藥典·第一部》標(biāo)準(zhǔn)。小承氣湯濃縮膏:大黃、枳實(shí)、厚樸按照生藥重量2∶1∶1的比例配制;大承氣湯濃縮膏:大黃、枳實(shí)、厚樸、芒硝按照生藥重量2∶3∶4∶1配制;藥物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)產(chǎn)業(yè)科技園有限公司制成濃縮膏定容為2 克生藥/毫升，收集揮發(fā)油水溶液用于稀釋濃縮膏。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠60 只，雄性，3 周齡，體重60～70 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0029】。SPF 級(jí)BALB/c 裸小鼠1 只，雄性，4周齡，Walker-256 大鼠肝癌細(xì)胞株購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2011-0029】。所有實(shí)驗(yàn)在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 實(shí)驗(yàn)室完成并獲得許可【SCXK(粵)2012-0081】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用按3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

在SPF 級(jí)屏障環(huán)境中，大鼠隨機(jī)分為4 組:正常組(同步飼養(yǎng)作脾虛造模的平行對(duì)照)、空白肝癌組(非脾虛，制作肝癌模型后作為脾虛肝癌模型的對(duì)照)、大承氣湯組(大承氣湯作為多因素脾虛模型制作中的苦寒瀉下因素)、小承氣湯組(小承氣湯作為多因素脾虛模型制作中的苦寒瀉下因素)，每組15只，自由進(jìn)食飲水1 周，之后開(kāi)始造模。

1.2.2 脾虛模型［1-3］

對(duì)照組和肝癌組正常干燥環(huán)境，自由飲食，給與生理鹽水1 mL/100g 體重每天1 次。大承氣湯組和小承氣湯組，墊料每天在常溫水中淘洗一次撈出至不滴水，每天常溫游泳至力竭(沉入水底2 ～3 s)，隔日禁食(如每周1、3、5 上午8 時(shí)清空飼料，僅留飲水，24 h 后添加飼料)，分別給予大小承氣湯1 g/100 g 體重，每天1 次，連續(xù)30 d。每天觀察大鼠體重變化(研究中對(duì)動(dòng)物體重每4 d 進(jìn)行一次統(tǒng)計(jì)，計(jì)算4 d 中的平均體重，方差分析各時(shí)間點(diǎn)大鼠體重的變化。)、精神狀態(tài)、進(jìn)食量、大便臟尾情況等，脾虛評(píng)分量表［4，5］評(píng)價(jià)脾虛嚴(yán)重程度(表1 各項(xiàng)目得分相加即為脾虛積分)。

1.2.3 肝癌模型［6-8］

Walker-256 細(xì)胞株以100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種于裸鼠頸背部，3 周后腫瘤長(zhǎng)至直徑0.5 cm 時(shí)，水合氯醛麻醉裸鼠，取出腫瘤去除壞死組織，將魚(yú)肉樣組織在生理鹽水中切割成1 mm3見(jiàn)方的小塊，置于冰上待用。脾虛大鼠停止造模后7d，肝癌組和脾虛組大鼠以乙醚吸入麻醉，劍突下脫毛膏去毛，75%醫(yī)用酒精消毒局部，切開(kāi)皮膚、鈍性分離腹肌，充分暴露肝臟，套管針吸取腫瘤組織，以45°斜角刺入肝臟左葉深處，每只動(dòng)物植入肝臟1 mm3瘤塊，壓迫止血，復(fù)位肝臟，分層縫合。觀察動(dòng)物生存情況，瀕危動(dòng)物及時(shí)處死解剖，并留取標(biāo)本，肝癌造模后35d 處死所有動(dòng)物。

表1 表觀指標(biāo)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［4］Tab.1 The phenotypic index grading standards［4］

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier 生存分析，P ＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 脾虛模型

2.1.1 各組脾虛積分比較

脾虛積分結(jié)果提示與空白組(4.67 ±2.85)比較，小承氣湯組和大承氣湯組脾虛積分明顯升高(P＜0.01)，并且平均分值分別為(18.67 ±5.04)和(17.13 ±5.44)符合典型脾虛模型的分值范圍。說(shuō)明多因素制作脾虛模型中小承氣湯和大承氣湯均可以獲得典型的脾虛模型。

2.1.2 各組脾虛造模過(guò)程中體重變化

與正常動(dòng)物比較，造模過(guò)程中脾虛動(dòng)物體重增長(zhǎng)受到明顯抑制，體重增長(zhǎng)曲線平緩，第30 天停止造模后大鼠體重快速增加，但仍低于正常組(P ＜0.01)。第20 天之前各時(shí)間點(diǎn)小承氣湯組大鼠體重均低于大承氣湯組(P ＜0.05)，之后二者體重接近(見(jiàn)圖1)。

圖1 脾虛大鼠體重變化Fig.1 Changes of body weight in the spleen deficiency rats.

2.2 肝癌模型

2.2.1 各組大鼠，肝、脾、胸腺重量及腫瘤體積的比較空白肝癌組和脾虛組(大承氣湯組、小承氣湯組)大鼠的肝、脾、胸腺重量相當(dāng)(P ＞0.05);而與正常組比較空白肝癌組和脾虛組大鼠的肝、脾、胸腺重量明顯降低(P ＜0.01 或0.05)(見(jiàn)表2)。各組大鼠肝癌體積無(wú)差異(P ＞0.05)。說(shuō)明肝癌造模后動(dòng)物內(nèi)臟重量的增長(zhǎng)受到抑制，此時(shí)可能由于脾虛造模因素停止，因此沒(méi)有顯示出脾虛肝癌模型與空白肝癌模型在內(nèi)臟重量方面的差異。

表2 各組大鼠肝、脾、胸腺重量及腫瘤體積的比較(±s，n=15)Tab.2 Comparison of the weight of liver，spleen and thymus and tumor volume in each group

表2 各組大鼠肝、脾、胸腺重量及腫瘤體積的比較(±s，n=15)Tab.2 Comparison of the weight of liver，spleen and thymus and tumor volume in each group

注:單因素方差分析，肝癌模型和脾虛模型臟器重量明顯低于正常大鼠，脾重F =15.175，P =0.000;肝重F =10.473，P =0.000;胸腺重F =19.342，P=0.000.與正常組比較，* P ＜0.01，# P ＜0.05。Note:One-way ANOVA test indicates that organ weight in the liver cancer models and spleen deficiency models is significantly lower than that of the normal rats:Spleen weight，F(xiàn) =15.175，P =0.000;Liver weight，F(xiàn) =10.473，P =0.000;and thymus weight，F(xiàn) =19.342，P =0.000.Compared with the normal group，* P ＜0.01 and # P ＜0.05.

項(xiàng)目Items 脾重/g Spleen weight肝重/g Liver weight胸腺重/g Thymus weight腫瘤體積均數(shù)/cm3 Tumor volume空白肝癌組Blank liver cancer 0.32 ±0.07* 7.48 ±1.56* 0.18 ±0.08* 2.43 ±2.87小承氣湯組Xiaochengqi 0.32 ±0.07* 7.92 ±1.23* 0.20 ±0.08* 2.51 ±2.50大承氣湯組Dachengqi 0.36 ±0.06* 8.13 ±1.15# 0.21 ±0.06* 2.56 ±2.08正常組Normal 0.57 ±0.03 11.25 ±1.75 0.41 ±0.06 －

2.2.2 各組大鼠成瘤率比較

大鼠成瘤率結(jié)果說(shuō)明總的成瘤率可以達(dá)到91.1%，大小承氣湯脾虛模型的成瘤率均為93.3%高于空白肝癌組的80%，脾虛積分高的動(dòng)物成瘤率高于脾虛積分低的動(dòng)物，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表3)。

表3 各組肝癌模型不同脾虛積分下成瘤率/%Tab.3 Tumor formation rate of the rats with different spleen deficiency scores

2.2.3 不同脾虛積分及各組肝癌模型平均生存天數(shù)比較

表4 的數(shù)據(jù)提示脾虛積分高的動(dòng)物生存時(shí)間明顯低于脾虛積分低的動(dòng)物;其中小承氣湯組脾虛積分在16 ～24 的肝癌大鼠生存時(shí)間低于該分?jǐn)?shù)段大承氣湯組的肝癌大鼠，也低于空白肝癌組的大鼠;小承氣湯組脾虛肝癌大鼠的生存時(shí)間也低于空白肝癌組和大承氣湯組。

表4 不同脾虛積分各組肝癌模型平均生存天數(shù)(±s)Tab.4 The mean survival days of rats with different spleen deficiency scores in each group (d)

表4 不同脾虛積分各組肝癌模型平均生存天數(shù)(±s)Tab.4 The mean survival days of rats with different spleen deficiency scores in each group (d)

注:脾虛積分指脾虛造模期間的脾虛積分。單因素方差分析，組間合計(jì)數(shù)據(jù)F =9.276，P =0.000，小承氣湯組合計(jì)平均生存天數(shù)低于空白肝癌組(* P=0.000)和大承氣湯組(# P=0.010);不同脾虛積分合計(jì)數(shù)據(jù)F=6.461，P=0.004，脾虛積分16 －24 合計(jì)平均生存天數(shù)低于脾虛積分小于6 的大鼠(△P=0.001);脾虛積分16 －24 大鼠在大承氣湯組平均生存天數(shù)高于小承氣湯組(※ F=3.197，P=0.040)。Note:Spleen deficiency score refers to the scores during spleen deficiency modeling period.One-way ANOVA test indicates the average survival days of rats in different groups，F(xiàn) =9.276，P =0.000.The average survival days of the Xiaochengqi group is significantly lower than that of the blank liver cancer group，* P =0.000 and that of the Dachengqi group，# P =0.010.One-way ANOVA test indicates F =6.461，P =0.004 for average survival days of the rats with different spleen deficiency scores，and compared with those with spleen deficiency scores ＜6，△P =0.001.Average survival days of rats with different spleen deficiency scores in the Diaochengqi group were higher than that of the Xiaochengqi group，※F =3.197，P =0.040.

項(xiàng)目Items脾虛積分≤6 Spleen deficiency scores≤6 7≤脾虛積分≤15 7≤Spleen deficiency scores≤15 16≤脾虛積分≤24 16≤Spleen deficiency scores≤24合計(jì)Total空白肝癌組Blank liver cancer 25.33 ±5.73 (n=15) 0 0 25.33 ±5.73 (n=15)*小承氣湯組Xiaochengqi 0 20.00 ±10.44 (n=3) 15.92 ±4.40 (n=12) 16.73 ±5.80 (n=15)大承氣湯組Dachengqi 0 23.80 ±7.73 (n=5) 21.40 ±3.31 (n=10)※22.20 ±5.05 (n=15)#合計(jì)Total 25.33 ±5.73(n=15)△ 22.38 ±8.31 (n=8) 18.41 ±4.76 (n=22) 21.42 ±6.49 (n=45)

2.2.4 不同脾虛積分各組肝癌模型生存分析

A:不同脾虛積分肝癌大鼠生存分析:脾虛積分≤6 的肝癌大鼠生存率明顯高于脾虛積分≥16 的肝癌大鼠，χ2=16.587，P =0.000;脾虛積分為7 －15分者生存率高于脾虛積分為16 －24 分者，χ2=3.440，P=0.064;脾虛積分7 －15 者與脾虛積分≤6者生存率相當(dāng)，χ2=0.114，P=0.736。B:不同組大鼠生存分析:空白肝癌組生存率高于小承氣湯組(χ2=10.687，P=0.001)和大承氣湯組(χ2=4.639，P=0.031);大承氣湯組生存率高于小承氣湯組(χ2=4.887，P =0.027)。結(jié)果提示，脾虛積分高的肝癌大鼠生存率低于脾虛積分低的肝癌大鼠;小承氣湯組的生存率低于大承氣湯組及空白肝癌組。

圖2 生存分析Fig.2 Resuts of survival analysis.

2.2.5 動(dòng)物模型外觀和組織圖像

圖3A 和圖3B 可見(jiàn)脾虛模型扎堆、臟尾的表現(xiàn);圖3C 和圖3D 可見(jiàn)肝癌大鼠腹水和腫瘤形成;圖3E為正常肝組織HE 染色200 倍鏡下圖像，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常;圖3F 為肝癌組織肝組織HE 染色200 倍鏡下圖像，癌組織結(jié)構(gòu)紊亂，癌細(xì)胞無(wú)序堆積(圖3 見(jiàn)彩插8)。

3 討論

本研究中，大鼠經(jīng)過(guò)寒濕外受、勞累、飲食饑飽過(guò)度、苦寒攻下連續(xù)30d 的造模，大鼠主要表現(xiàn)為體重生長(zhǎng)緩慢、臟尾、扎堆、被毛豎立等(圖3A，圖3B)。脾虛積分結(jié)果提示，大承氣湯組和小承氣湯組脾虛積分明顯高于空白肝癌組。體重變化結(jié)果提示多因素造模下，相對(duì)于正常組脾虛大鼠體重增長(zhǎng)受到明顯抑制，但是，停止造模后1 周內(nèi)大鼠脾虛癥狀逐漸消退，體重增加顯著。大承氣湯作為苦寒攻下因素，在造模中大鼠體重增長(zhǎng)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均高于小承氣湯，在20d 前各時(shí)間點(diǎn)P ＜0.05，而之后則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。因此，本研究采用的多因素造模方法可以獲得符合中醫(yī)脾虛理論的脾虛模型，并且小承氣湯對(duì)脾胃的損傷作用可能較大承氣湯明顯。

大鼠接種肝癌后，可在1 周內(nèi)迅速長(zhǎng)出腫瘤，部分大鼠逐漸出現(xiàn)腹水、消瘦、被毛豎立、體重下降、精神萎靡的表現(xiàn)(圖3C)。上述癥狀在2 ～3 周達(dá)到高峰，模型往往在此期間因體能不支而接受處死，被采集標(biāo)本。肝癌動(dòng)物呈現(xiàn)肝臟巨塊肝癌及腹腔轉(zhuǎn)移(圖3D)，空白肝癌組肝癌體積與大承氣湯組、小承氣湯組無(wú)明顯差別，但肝癌動(dòng)物脾臟和胸腺往往萎縮明顯，肝臟重量也低于正常動(dòng)物(表2)。研究中，解剖證實(shí)總的成瘤率為91.1%(肝癌形成肝臟腫塊或腹腔種植肝癌結(jié)節(jié)，不包括腹水形成而后消退的動(dòng)物)，脾虛動(dòng)物與正常動(dòng)物差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。這些情況說(shuō)明，本研究中移植性肝癌可以在大鼠肝臟內(nèi)形成腫瘤，獲得與中晚期臨床肝癌相似的肝癌模型。雖然大鼠體重與內(nèi)臟重量有一定的相關(guān)性，但并非總是線性相關(guān)，本研究中正常大鼠體重明顯高于肝癌模型和脾虛肝癌模型大鼠，計(jì)算內(nèi)臟重量指數(shù)后，正常組的內(nèi)臟相對(duì)重量反而低于肝癌和脾虛肝癌模型組，因此，本研究中只計(jì)算內(nèi)臟的原始重量，模型組大鼠內(nèi)臟萎縮的意義也還有待進(jìn)一步研究。

有少數(shù)動(dòng)物(空白肝癌組有3 只大鼠、大承氣湯組和小承氣湯組各1 只大鼠)可以安全渡過(guò)這段時(shí)間，腹脹、腹水逐漸減輕并最終緩解，解剖后接種腫瘤僅留下一個(gè)1 mm 大小乳白色疤痕，但脾虛積分高的大鼠成瘤率較高(表3)。這些情況提示移植性肝癌受到機(jī)體的排斥有一定的消退趨勢(shì)，但脾虛可能不利于移植瘤的消退。

對(duì)肝癌模型平均生存時(shí)間的分析提示，空白肝癌組和大承氣湯組的模型平均生存天數(shù)高于小承氣湯組，P ＜0.05;小承氣湯組脾虛積分16 ～24 的肝癌模型生存天數(shù)也少于大承氣湯組，P ＜0.05;脾虛積分≤6 分的肝癌模型生存天數(shù)多于脾虛積分16 ～24 的動(dòng)物(表4)。進(jìn)一步對(duì)于不同脾虛積分肝癌模型生存分析也提示脾虛積分高的肝癌模型和小承氣湯組肝癌模型的生存能力明顯下降(圖2A、圖2B)。這說(shuō)明脾虛嚴(yán)重不利于肝癌模型的生存，小承氣湯制作脾虛的作用可能比大承氣湯強(qiáng)。由于脾虛積分是在制作脾虛模型期間評(píng)價(jià)的，停止造模后脾虛動(dòng)物的體重有明顯恢復(fù)，但是脾虛嚴(yán)重的動(dòng)物在后期肝癌模型中的生存情況較差，說(shuō)明大鼠脾虛證可能沒(méi)有隨著體重恢復(fù)而明顯恢復(fù)。

總之，本研究的結(jié)果提示小承氣湯在多因素制作脾虛模型過(guò)程中致脾虛作用比大承氣湯強(qiáng)，脾虛明顯是肝癌模型預(yù)后不良的重要因素。

(本文圖3 見(jiàn)彩插8。)

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