王偉科，陸 娜，周祖法，宋吉玲，袁衛(wèi)東，閆 靜

（浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024）

8種胞外酶在香菇不同生長階段的活性變化

王偉科，陸 娜，周祖法，宋吉玲，袁衛(wèi)東，閆 靜

（浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024）

研究了香菇生長過程不同階段胞外酶纖維素酶系 （羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶）、木質(zhì)素酶系 （漆酶、愈創(chuàng)木酚酶、多酚氧化酶）、淀粉酶、半纖維素酶的活性變化。結(jié)果表明,香菇生長不同階段均能檢測到上述8種酶的活性,說明這些酶參與了香菇生長發(fā)育的全過程。各種酶活性峰值出現(xiàn)時間不盡相同,木質(zhì)素酶的活性高峰出現(xiàn)在營養(yǎng)生長期,纖維素酶的活性高峰出現(xiàn)在生殖生長期,說明香菇生長過程中優(yōu)先利用木質(zhì)素。8種酶活性在香菇生殖生長階段變化趨勢較一致,從原基形成到子實體成熟均呈現(xiàn)逐步下降趨勢。

胞外酶活性；香菇；不同生長階段；變化規(guī)律

香菇屬擔子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、香菇屬［1］,其主要栽培基質(zhì)是雜木屑。香菇生長過程中所需的營養(yǎng)主要通過菌絲向胞外分泌各種酶將木質(zhì)纖維素及其他有機大分子物質(zhì)降解后再吸收進細胞,并轉(zhuǎn)化為蛋白及多糖等［2］獲取。研究不同培養(yǎng)條件對香菇胞外酶活性影響的報道較為多見,但對香菇從菌絲生長到子實體成熟采收全過程中的酶活性變化研究報道甚為少見,為此測定并分析了8種胞外酶在香菇生長過程6個重要階段的活性及變化過程,旨在深入了解香菇對栽培基質(zhì)的降解利用規(guī)律和生長發(fā)育過程中的生理變化,為栽培基質(zhì)配方的設(shè)置提供理論依據(jù)。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

l 材料與方法

1.1 菌種

香菇808引自縉云縣山農(nóng)農(nóng)產(chǎn)品科技開發(fā)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

雜木屑78%,麩皮20%,石膏1%和糖1%。

1.3 粗酶液提取

每一生長階段隨機挑取3個菌棒,搗碎后混勻,準確稱取培養(yǎng)料2份,每份5 g。1份樣品加入25 m L去離子雙蒸水,40℃浸提2 h,5 000 r· min-1,4℃離心10 min,取上清液,得粗酶液。另1份樣品置于80℃下烘至恒重,稱重。

1.4 葡萄糖和木糖標準曲線制作

［3］的方法制作葡萄糖和木糖的標準曲線。得到葡萄糖標準曲線回歸方程Y= 0.812X-0.037,R2=0.958 6,木糖標準曲線回歸方程Y=0.780 3X-0.027 6,R2=0.983 4。

1.5 胞外酶活性測定與定義

羧甲基纖維素酶。往試管中加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液 （用pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制）1.5 m L,再加入粗酶液0.5 m L,混勻,50℃恒溫水浴保溫30 m in,取出后立即加入DNS試劑1.5 m L,煮沸5 min,取出,冷卻后加蒸餾水定容至20 m L,充分混勻。分光光度計540 nm波長處測光密度值 （D）,以煮沸滅活的酶液作對照,每組3次重復(fù),取平均值。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1個活力單位 （U）。

濾紙纖維素酶。往試管中加入粗酶液0.5 m L,再加入濾紙條50 mg（新華定量濾紙,約1 cm×6 cm）,50℃恒溫水浴保溫1 h,其后操作與羧甲基纖維素酶活性測定相同。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用60 m in釋放出1 mg葡萄糖為1 U。

半纖維素酶。往試管中加入0.5% （用pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制）木聚糖溶液1.5 mL,加入粗酶液混勻,50℃水浴保溫1 h,其后操作與羧甲基纖維素酶活性測定相同。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg木糖為1 U。

淀粉酶。往試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液（用pH值5.8,0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制）1.5 m L,加粗酶液0.5 m L,混勻,38℃恒溫水浴保溫30 min,其后操作與羧甲基纖維素酶活性測定相同,并于520 nm測 D值。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1 U。

β-葡萄糖苷酶。取0.5 m L粗酶液,加入0.5 m L,10 mmol·L-1β-D-葡萄糖苷。將此反應(yīng)混合液37℃反應(yīng)2.5 h,待反應(yīng)結(jié)束后,立即加入2.5 mL,1 mol·L-1Na2CO3終止液終止反應(yīng),冷卻至室溫后在400 nm波長處測D值。另外,取相同條件的反應(yīng)液立即置于沸水浴中加熱5 min滅活后加入2.5 m L,1 mol·L-1Na2CO3溶液,作為空白對照。酶活力單位：1U指使底物改變0.01吸光度所需要的酶量。

漆酶。往試管中加入3.36 mmol·L-1的鄰聯(lián)甲苯胺0.5 mL和pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸緩沖液3.4 mL,樣品管中再加入粗酶液0.1 mL,對照管中加入煮沸滅活的粗酶液0.1 mL,混勻,28℃恒溫水浴保溫30 min,取出后立即于分光光度計600 nm波長測D值。酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后的光密度的改變值表示。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量每分鐘使D600值改變0.01為1 U。

多酚氧化酶。在試管中加入2.0 m L, 0.1 mol·L-1的鄰苯二酚,2.0 m L,0.05 mol·L-1的磷酸鉀 （pH值6.0）緩沖液和0.1 m L粗酶液。反應(yīng)液28℃保溫30 m in后立即用紫外分光光度計400 nm處測D值。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物30 min內(nèi)改變0.1個光密度值為1 U。

愈創(chuàng)木酚酶。取0.5 m L粗酶液,加入3 m L pH值4.6,0.1 mol·L-1乙酸鹽緩沖液,0.5 m L 80 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚,28℃恒溫水浴反應(yīng)30 min,取出在600 nm處測定D值。1 U為使底物改變0.01吸光度所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶活性變化

從圖1可知,從發(fā)菌到子實體成熟整個過程看,羧甲基纖維素酶的活性呈現(xiàn)為先降后升再降的變化過程。在發(fā)菌期,羧甲基纖維素酶活性較為穩(wěn)定,基本維持在5 U左右；當菌棒進入轉(zhuǎn)色階段后,其活性稍有下降；而當原基至幼菇形成階段,其活性又隨之升高；從幼菇生長到子實體成熟階段,其活性又呈現(xiàn)下降趨勢。濾紙纖維素酶活性則在原基期至幼菇期達到峰值6.92 U,從幼菇到子實體成熟階段又表現(xiàn)為逐漸下降。

2.2 β-葡萄糖苷酶活性變化

從圖2可以看出,β-葡萄糖苷酶活性從菌絲發(fā)菌初期開始逐漸上升,到原基形成階段達到高峰,峰值為88.33 U,隨后隨著原基的分化和幼菇生長,其活性又逐漸下降,到子實體成熟階段,其活性也降至最低點。

圖1 不同香菇生長發(fā)育階段羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶活力的變化

圖2 不同香菇生長發(fā)育階段β-葡萄糖苷酶活力的變化

2.3 半纖維素酶活性變化

試驗結(jié)果 （圖3）表明,半纖維素酶活性變化表現(xiàn)為 “M”型走勢,在菌絲營養(yǎng)生長階段緩慢上升,在菌絲滿袋到轉(zhuǎn)色期這一階段,其活性快速上升并達到高峰,峰值為5.24 U,原基形成階段稍有下降,到幼菇生長階段再次上升到5.13 U。從幼菇生長到子實體成熟階段的變化又表現(xiàn)為下降。

圖3 不同香菇生長發(fā)育階段半纖維素酶活力的變化

2.4 淀粉酶活性變化

圖4可知,淀粉酶活性在香菇整個生長發(fā)育階段呈現(xiàn)典型的先升后降趨勢。在營養(yǎng)生長階段活性變化不大,基本維持在2 U水平；當菌棒進入轉(zhuǎn)色階段時,其活性迅速上升達到峰值5.14 U,隨著原基分化、幼菇形成直至最后子實體成熟,淀粉酶活性逐漸下降,子實體成熟采摘期淀粉酶活性降至最低。

圖4 不同香菇生長發(fā)育階段淀粉酶活力的變化

2.5 漆酶、愈創(chuàng)木酚酶和多酚氧化酶活性變化

漆酶、愈創(chuàng)木酚酶和多酚氧化酶的活性可以衡量香菇菌絲對木質(zhì)素的降解能力。結(jié)果 （圖5-6）表明,3種酶的活性變化趨勢表現(xiàn)十分相似。菌絲生長初期三者均表現(xiàn)為較高的活性,到菌絲滿袋階段活性均有所下降；當菌棒進入轉(zhuǎn)色階段后,三者的活性又呈現(xiàn)上升趨勢；此后又一致呈現(xiàn)為下降趨勢。三者在營養(yǎng)生長階段活性均高于生殖生長階段,說明對木質(zhì)素的利用集中在菌絲生長階段。

圖5 不同香菇生長發(fā)育階段漆酶、愈創(chuàng)木酶活力的變化

圖6 不同香菇生長發(fā)育階段多酚氧化酶活力的變化

3 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明,從纖維素酶系中的羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和 β-葡萄糖苷酶 3種酶的變化趨勢看,總體呈現(xiàn)出一定的相似性,均在原基和幼菇形成階段達到峰值,說明在這一階段培養(yǎng)基質(zhì)中大量的纖維素被降解利用,從而為香菇原基的分化和幼菇正常生長提供充足的碳源。

在木質(zhì)素降解過程中漆酶、多酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶等酚氧化酶起著重要作用。香菇在菌絲生長階段的前期,漆酶、多酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶的活性較高,這與馮志勇等［4］的研究結(jié)果相一致。試驗中發(fā)現(xiàn),漆酶、愈創(chuàng)木酚酶和多酚氧化酶在香菇生長發(fā)育的過程中變化趨勢十分相似,因此這3種酶對于分解木質(zhì)素是否具有相互促進作用還有待于進一步研究。

試驗中發(fā)現(xiàn)：香菇胞外酶的木質(zhì)素降解酶活性高峰位于菌絲營養(yǎng)生長階段；纖維素降解酶的活性高峰集中出現(xiàn)在生殖生長階段；而非纖維木質(zhì)素酶系的半纖維素酶和淀粉酶活性高峰卻出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期。由此可見,一是香菇胞外酶系之間的活性變化可能存在一定的互補性,這更有利于充分降解利用栽培基質(zhì)中的各種營養(yǎng)成分,使得香菇生長發(fā)育過程中能獲得持續(xù)不斷的營養(yǎng)供給。另一方面也說明香菇生長發(fā)育過程中會優(yōu)先降解栽培基質(zhì)中的木質(zhì)素,這與張曉昱［5］研究相一致。即當進入生殖生長階段后,木質(zhì)素酶系活性會迅速降低,纖維素酶系活性則快速上升,促進纖維素分解和利用,從而為原基形成、分化與生長提供能量。

在香菇整個生長發(fā)育過程中,菌棒轉(zhuǎn)色是一個十分關(guān)鍵且特有的階段。本次試驗測定的8種胞外酶除了羧甲基纖維素酶活性在這一階段稍有下降外,其余7種酶的活性在這一階段均表現(xiàn)為上升趨勢,而且其中有5種酶活性在這個階段形成峰值,之后又迅速下降。而香菇轉(zhuǎn)色成功與否與產(chǎn)量和質(zhì)量均具有密切的關(guān)系［6-7］,因此這些酶與香菇產(chǎn)量、品質(zhì)等是否具有相關(guān)性有待于進一步研究。

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（責任編輯：吳益?zhèn)ィ?/p>

S 646

：A

：0528-9017（2014）04-0498-03

文獻著錄格式：王偉科,陸娜,周祖法,等.8種胞外酶在香菇不同生長階段的活性變化 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（4）：498-501.

2014-02-11

杭州市科技發(fā)展計劃社會發(fā)展科研專項 （20120433B11）

王偉科 （1981-）,男,浙江寧海人,農(nóng)藝師,大學(xué)本科,主要從事食用菌育種和栽培技術(shù)研究工作。E-mail：akeok@126.com。

袁衛(wèi)東,男,高級農(nóng)藝師,主要從事食用菌研究與推廣工作。E-mail：ywd0507@126.com。