李 薇,王文平,陳 亮,王珍祥,李世榮

(第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院整形外科,重慶 400038)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向受損組織的定向遷移已經(jīng)成為 MSCs 研究的關(guān)鍵問題，但相應(yīng)的機(jī)制仍不十分清楚[1-3]。同時，機(jī)體受損部位MSCs被募集時，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達(dá)上調(diào)，有可能通過誘導(dǎo)MSCs 定向遷移參與組織修復(fù)[4-6]。但迄今為止，OPN 與 MSCs 遷移方面的研究甚少[7]，因此本研究擬通過應(yīng)用外源OPN，觀察其對 MSCs 遷移能力的影響，探索 OPN 不同受體在 MSCs 遷移過程中的作用，闡明 OPN 影響 MSCs 遷移行為的機(jī)制，為促進(jìn)創(chuàng)傷愈合尋求新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料 重組小鼠OPN，美國Gibco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)，蘭州明海公司；Transwell系統(tǒng)，孔徑為8 μm、膜直徑為6.4 mm，美國BD公司；改良伊格爾(DMEM/F-12)培養(yǎng)液，美國HyClone公司；鼠抗OPN單克隆抗體、鼠抗CD44 單克隆抗體，美國Santa Cruze公司；鼠抗Integrin β1 單克隆抗體，Cell Signaling Technolog；GHPDH蛋白 Marker，北京中衫公司；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；PE標(biāo)記小鼠抗大鼠 CD34、CD105抗體，美國Santa Cruze公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物與分組 OPN-/-小鼠來自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室；野生型C57小鼠來自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院SPF級動物室。細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)無細(xì)胞培養(yǎng)液為空白對照組；(2)OPN-/-小鼠MSCs為蛋白表達(dá)陰性組；(3)OPN治療組，在OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN，達(dá)到0.5 μg/mL的濃度培養(yǎng)MSCs；(4)野生型C57小鼠MSCs為OPN陽性組。以上實(shí)驗(yàn)每組設(shè) 3個樣本，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2胎鼠原代MSCs培養(yǎng) 取孕19 d雌鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡10 min。無菌鑷子及剪刀配合取出胎鼠，置于裝有冷磷酸鹽緩沖液(PBS)的玻璃皿內(nèi)。剪下胎鼠四肢，輕柔仔細(xì)取出胎鼠長骨周圍軟組織，剃出長骨至新的培養(yǎng)皿中，盡量剪碎骨組織加入裝有培養(yǎng)液DMEM/F-12+10% FBS的玻璃平皿內(nèi)，吸管吹散，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾后，濾液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。DMEM/F-12+10% FBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞貼壁，進(jìn)行換液。細(xì)胞融合至80%視野時進(jìn)行傳代。

1.2.3流式細(xì)胞儀分選培養(yǎng)細(xì)胞 胎鼠MSCs經(jīng)傳代后鏡下見雜細(xì)胞逐漸增多，傳至P3，行流式分選以純化。方法如下：所有胎鼠MSCs用PBS洗兩遍，胰酶消化，鏡下控制反應(yīng)時間，待細(xì)胞變圓從瓶壁脫落終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)1 000 r/min離心 10 min，棄上清液。PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心 10 min，棄上清液。PBS重懸，計數(shù)板計數(shù)，得細(xì)胞數(shù)4×105個，分A、B、C、D 4個EP管，每管1×105。A管內(nèi)不加抗體，B管內(nèi)加入2.5 μL CD105 PE抗體，C管內(nèi)加入2.0 μL CD34 FITC抗體，D管內(nèi)加入2.5 μL CD105 PE及2.0 μL CD34 FITC抗體。4 ℃孵育1 h，不時混勻，1 000 r/min離心 10 min。于冰盒內(nèi)送至西南醫(yī)院癌癥中心進(jìn)行流式分選。

1.2.4Transwell 檢測細(xì)胞遷移 取P3的MSCs，處理 24 h以后，酶消化并計數(shù)。細(xì)胞懸液離心，去除完全培養(yǎng)基，PBS清洗2次。加入培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度為2×103μL-1。 將2×105細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中， 在下室中加入600 μL的F12-DMEM培養(yǎng)基和OPN混合均勻，使OPN終濃度為0.5 μg/mL，靜置6 h； 其后在孵育12、24、36 h，取出Transwell小室，擦去小室膜上面的未遷移的細(xì)胞，倒置風(fēng)干；再在每孔中加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，將小室置于其中，同時使膜完全浸沒在結(jié)晶紫溶液中。室溫 30 min 后將小室取出，PBS 清洗，風(fēng)干； 最后將小室的膜面正置于載玻片上，倒置顯微鏡下觀察。選取4個視野計數(shù)，得到遷移細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.2.5蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測 參考文獻(xiàn)[7],取第3代MSCs，加入F12-DMEM培養(yǎng)基和相應(yīng)的外源重組OPN，使得細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%終止培養(yǎng)，收獲細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，上樣量40 μg，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗OPN(1∶500)、CD44(1∶800)、 Integrin β1(1∶1 000) ，4 ℃孵育過夜。洗膜，分別加HRP 標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5 000)，繼續(xù)孵育2 h，加ECL發(fā)光液，X射線曝光顯影。GAPDH為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)用SensiAnsys 軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1MSCs 的形態(tài)學(xué)觀察 剛轉(zhuǎn)移的細(xì)胞呈圓形，不均勻懸浮于培養(yǎng)液中。24 h 后細(xì)胞可見貼壁，大部分呈圓形。72 h后，細(xì)胞開始呈短梭形纖維狀、三角形或星形。未貼壁的雜細(xì)胞容易被除去。6 d左右，細(xì)胞集落放射狀排列，并在14 d左右時細(xì)胞達(dá)到 85%融合。傳代后細(xì)胞24 h內(nèi)呈纖維狀完全伸展。 傳代細(xì)胞4～6 d超過80%融合，呈現(xiàn)更強(qiáng)的增殖能力，形成細(xì)胞形態(tài)趨于一致的漩渦樣單層。

A:小鼠MSCs遷移數(shù)量最多；B:0.5 μg/mL的OPN能顯著增加OPN-/-MSCs的遷移細(xì)胞數(shù)；C：OPN-/-MSCs遷移極少；組標(biāo)1、2、3：觀察時間12、24、36 h。

圖1 OPN影響MSCs遷移

2.2流式細(xì)胞儀分選培養(yǎng)MSCs 結(jié)果 MSCs 對CD90、CD105、CD29、CD44等表面標(biāo)記抗原呈陽性，而對CD34、CD35 CD14等造血干細(xì)胞表面標(biāo)記抗原呈陰性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD34 呈陰性(1.02%)，CD44呈陽性(96.10%)，CD105 呈陽性(95.30%)，細(xì)胞純化度較高。分離得到的細(xì)胞表達(dá) CD44 和 CD105，但不表達(dá) CD34，符合 MSCs 表面標(biāo)記抗原的一般規(guī)律。

2.3OPN 促M(fèi)SCs 定向遷移 與空白對照組相比，OPN治療組能增加體外MSCs的細(xì)胞遷移，而OPN陽性組MSCs遷移為最多。同時，這一趨勢與OPN作用時間正相關(guān)，培養(yǎng)36 h細(xì)胞遷移數(shù)多于24 h，而24 h又多于12 h(圖1)。 進(jìn)一步，以O(shè)PN作用時間36 h細(xì)胞遷移數(shù)作統(tǒng)計分析，OPN陽性組能使MSCs 的遷移細(xì)胞數(shù)增加 2倍以上(圖2)，而OPN治療組能顯著增加MSCs的遷移細(xì)胞數(shù)，也超過了1倍，與OPN陰性組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。再以MTT 法檢測在遷移過程中活細(xì)胞的數(shù)目，結(jié)果表明不同濃度的 OPN 均不會使MSCs細(xì)胞數(shù)明顯改變。

2.4外源性重組OPN 可以促進(jìn)MSCs細(xì)胞中OPN蛋白表達(dá) 將OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN(達(dá)到0.5 μg/mL的濃度)，孵育36 h通過Western blot檢測OPN-/-與野生型C57小鼠MSCs OPN表達(dá)發(fā)現(xiàn)，若以O(shè)PN陰性組為基數(shù)100，OPN治療組蛋白量明顯增加，但仍低于OPN陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖2 OPN影響MSCs遷移比率變化比較

圖3 Western blot檢測加入外源性O(shè)PN后MSCs中OPN蛋白表達(dá)變化

圖4 Western blot檢測OPN影響MSCs相關(guān)蛋白表達(dá)變化的比較

2.5OPN促進(jìn)MSCs細(xì)胞中Integrin β1 和 CD44蛋白表達(dá) 在孵育36 h通過Western blot檢測各組MSCs OPN表達(dá)發(fā)現(xiàn)，若以O(shè)PN陰性組為基數(shù)100，OPN治療組CD44蛋白表達(dá)增多，定量分析增加明顯，但OPN陽性組細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多，定量分析增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同樣的結(jié)果，若以O(shè)PN陰性組為基數(shù)100，OPN治療組Integrin β1蛋白表達(dá)增多，差異明顯，而OPN陽性組細(xì)胞Integrin β1蛋白表達(dá)最多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

3 討 論

MSCs 具有很強(qiáng)的體外增殖能力，并同時保持多向分化潛能，因此可作為組織修復(fù)的種子細(xì)胞，也是多種修復(fù)細(xì)胞的來源，在損傷愈合中具有重要而關(guān)鍵的作用，但許多有關(guān)MSCs的作用環(huán)節(jié)仍然不甚清楚，需要進(jìn)一步研究[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中，骨髓提取細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)與MSCs一致。流式細(xì)胞儀檢測表明CD34 呈陰性，CD44、CD105 呈陽性，細(xì)胞純化度超過90%。因此，使用適量的骨髓便可獲得足量的 MSCs。

OPN 可以介導(dǎo)多種細(xì)胞的黏附與遷移[10]。OPN 的缺失降低機(jī)體損傷修復(fù)功能。缺氧條件下，受損部位 OPN 表達(dá)上升，同時誘導(dǎo)MSCs遷移至受損部位，參與組織修復(fù)[7]。但OPN 在 MSCs定向遷移過程中的作用與調(diào)節(jié)機(jī)制仍未引起重視。 本研究將OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN(達(dá)到0.5 μg/mL)，孵育36 h通過Western blot檢測OPN-/-小鼠與野生型C57小鼠MSC細(xì)胞OPN表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在OPN-/-小鼠加入重組OPN，細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)量明顯增加，但仍低于野生型C57小鼠。分析結(jié)果證實(shí)，OPN 能夠誘導(dǎo)MSCs 定向遷移。0.5 μg/mL的OPN能增加體外MSCs的細(xì)胞遷移，而野生型C57小鼠MSC細(xì)胞遷移為最多。同時，這一趨勢與OPN作用時間呈正相關(guān)，與OPN-/-小鼠相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OPN 促進(jìn)MSCs 定向遷移的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

CD44是另一種 OPN 細(xì)胞表面受體，可以介導(dǎo) OPN 促細(xì)胞遷移，阻斷 CD44 能夠抑制OPN 促M(fèi)SCs遷移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)， 0.5 μg/mL重組OPN促進(jìn)CD44蛋白表達(dá)增多，定量分析增加非常明顯，但野生型C57小鼠細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多，相互比較CD44蛋白增加最為顯著。結(jié)果表明，OPN 能夠增加MSCs 中CD44的表達(dá)，同時通過結(jié)合細(xì)胞表面Integrin β1 受體，促進(jìn)MSCs 定向遷移。

Integrin β1 直接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和組織重構(gòu)。而OPN 促M(fèi)SCs 遷移的同時，是否改變了Integrin β1 的表達(dá)情況值得研究[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，OPN 可以增加Integrin β1 的表達(dá)量。OPN作用與時間呈正相關(guān)，OPN-/-小鼠MSCs加入重組OPN孵育時間越長，Integrin β1 的蛋白就越高。 MSCs 可能通過Integrin β1，從而定向遷移至缺血性心肌組織中[13]。一旦阻斷Integrin β1 后，OPN 促M(fèi)SCs 遷移過程受到抑制，表明Integrin β1參與 OPN促M(fèi)SCs定向遷移。

綜上所述，OPN 具有促M(fèi)SCs 定向遷移的能力，且其作用與 OPN 濃度以及作用時間有關(guān)。同時，OPN 提高CD44、Integrin β1 受體的蛋白表達(dá)水平， 如果阻斷后兩者受體，OPN 促M(fèi)SCs 定向遷移的能力受到抑制。因此， OPN可能通過上調(diào)MSCs 中CD44、Integrin β1 受體的表達(dá)，促進(jìn)MSCs遷移。

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