宗兆文,陳思旭,賈 敏,華 祥,郭慶山,沈 岳,趙玉峰,劉道城,Jerry Feng

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷/燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)傷科，重慶 400042；2.德克薩斯州衛(wèi)生科學(xué)中心Baylor醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，美國德克薩斯州達(dá)拉斯75246)

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[1]。骨質(zhì)疏松不僅威脅中老年人的健康，也給家庭和社會(huì)帶來的沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨質(zhì)疏松被認(rèn)為是一個(gè)多因素疾病，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明了，導(dǎo)致其防治效果不佳[2-3]。Osterix是重要的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，被證實(shí)在成骨細(xì)胞的成熟和向骨細(xì)胞的終末分化中起到重要作用[4-6]。本研究通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除的方法觀察Osterix在調(diào)控脊椎骨量中的作用，并探索其可能機(jī)制，以期為探索骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制提供一定線索。

1 材料與方法

1.1材料 Osterix Lox P +/+ 小鼠、2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠和3.6- kb Cre Osterix 轉(zhuǎn)基因小鼠由美國德克薩斯州衛(wèi)生科學(xué)中心 Baylor醫(yī)學(xué)院Jerry Feng教授饋贈(zèng)。Osterix Lox P +/+小鼠和2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠雜交以獲得Osterix Lox P +/+;2.3 kb Collagen Ⅰ Cre小鼠進(jìn)而敲除Osterix。

1.2方法

1.2.1常規(guī)PCR進(jìn)行基因型鑒定 取新生9 d小鼠適量尾巴，常規(guī)方法提取基因組DNA，然后取1 μg提取的DNA常規(guī)PCR進(jìn)行基因型鑒定。Osterix敲除小鼠使用的引物為：5′-CTT GGG AAC ACT GAA GCT GT-3′和 5′-CTG TCT TCA CCT CAA TTC TAT T-3′；Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠使用的引物為：5′-GAA GCG ACC ACT TGA GCA AAC AT-3′和5′- TGT CCA AAC TCA TCA ATG TAT CT-3′。

1.2.2X線片檢查 出生后12周，戊巴比妥那過量麻醉致死野生型小鼠、Osterix 轉(zhuǎn)基因小鼠和Osterix敲除小鼠(n=4)，取腰段脊柱，4%多聚甲醛4 ℃過夜固定，次日剔除脊柱周圍軟組織，拍攝脊柱X線片。

1.2.3顯微電子計(jì)算機(jī)X線斷層攝影術(shù)(micro-computerized tomography,Micro-CT)檢測 取上述小鼠第5腰椎，采用Micro-CT機(jī)(Scanco Medical,Bassersdorf,Switzerland)進(jìn)行常規(guī)掃描，計(jì)算其骨量與脊椎總體積的比值(bone volume / total volume,BV/TV)。

1.2.4組織學(xué)處理 取上述標(biāo)本中的第5腰椎10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣后，制備石蠟切片。冠狀面5 μm切片，常規(guī)脫蠟和梯度乙醇水化切片備用。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色 5 μm組織切片常規(guī)進(jìn)行HE染色。方法簡述如下：取1.3中準(zhǔn)備好的切片蘇木素染色5 min，自來水沖洗1～3 s后1%鹽酸乙醇分色1～3 s。蒸餾水過洗 1～2 s后0.5%伊紅染色 1 min，蒸餾水稍洗 1～2 s后梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固切片。

1.2.6抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 預(yù)熱兩個(gè)裝有50 mL基礎(chǔ)孵育液的玻璃染色缸至37 ℃，然后在其中一個(gè)加入50 μL 2% 磷酸萘酚，加入1.2.3處理好的片子，37 ℃孵育45 min。然后將1 mL 5%副品紅和 1 mL 4%亞硝酸鈉混勻后加入另一個(gè)染色缸，將切片轉(zhuǎn)移到第二個(gè)染色缸，染色約2 min。蒸餾水漂洗后用甲基綠對抗染色，然后常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固切片。其中基礎(chǔ)孵育液配制方法為將9.2 g無水醋酸鈉、11.4 g無水酒石酸鈉和2.8 mL冰醋酸加入蒸餾水，并定容為1 000 mL，并調(diào)節(jié)pH值為4.7～5.0。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色 取1.2.3中準(zhǔn)備好的切片，3%H2O2封閉切片用1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)充分漂洗后加非特異性封閉血清室溫封閉1 h后加羊抗兔RANKL一抗，4 ℃孵育過夜。次日PBS漂洗3次后加入相生物素化小鼠抗養(yǎng)二抗，室溫孵育1 h。PBS充分漂洗后DAB顯色，適度顯色后蒸餾水終止反應(yīng)然后用甲基綠對抗染色。

2 結(jié) 果

2.1Osterix敲除小鼠骨量增加 Mico-CT結(jié)果顯示，Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠中的骨小梁數(shù)量同野生型小鼠之間無明顯差異，而Osterix敲除小鼠第5腰椎中骨量大量增加，明顯高于野生型小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

A：野生型小鼠第5腰椎；B：Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠腰椎；C：Osterix敲除小鼠腰椎；D：3種小鼠中骨量定量分析結(jié)果。

圖1 Micro-CT檢測3種小鼠脊椎中骨量的差別。

A：Osterix敲除小鼠(左)和野生型小鼠(右)的X線片；B:Osterix敲除小鼠的HE染色；C：野生型小鼠的HE染色；D：Osterix敲除小鼠的TRAP染色；E：野生型小鼠的TRAP染色；F：Osterix敲除小鼠的RANKL免疫組織化學(xué)染色；G：野生型小鼠的RANKL免疫組織化學(xué)染色。

圖2 Osterix敲除小鼠的特征

A：Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠(左)和野生型小鼠(右)的X線片；B:Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠的HE染色；C：野生型小鼠的HE染色；D：Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠的TRAP染色；E：野生型小鼠的TRAP染色。

圖3 Osterix過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的特征

2.2Osterix敲除小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量減少 X線片檢測顯示在出生后12周，Osterix敲除小鼠脊椎骨密度增加，HE檢測顯示其椎體中骨量增加。采用TRAP染色檢測了Osterix敲除小鼠脊椎中破骨細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Osterix敲除小鼠脊椎中破骨細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度明顯低于野生型小鼠。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Osterix敲除小鼠脊椎中RNAKL表達(dá)水平低于野生型小鼠，見圖2。

2.3Osterix過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠骨量無顯著變化 而在Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠中，脊椎X線片顯示其密度和HE染色顯示其骨量同野生型小鼠無顯著差異。同時(shí)，TRAP染色和免疫組織化學(xué)檢測顯示Osterix轉(zhuǎn)基因小鼠脊椎中破骨細(xì)胞數(shù)量和RNAKL表達(dá)水平同野生型小鼠無顯著性差異，見圖3。

3 討 論

隨著世界人口日趨老齡化，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來越高，對中老年人的身體健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。骨質(zhì)疏松治療主要的目的是提高骨強(qiáng)度以減少骨折的發(fā)生率[7]。骨強(qiáng)度由多種因素決定，其中骨量是重要因素之一[8-10]。參與骨量調(diào)節(jié)的因素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有多種，但尚不確定哪種因素或哪條信號通路起到重要作用[3,11-14]。

Osterix是成骨過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子。胚胎期敲除Osterix導(dǎo)致小鼠完全沒有骨性成分形成，出生后敲除Osterix后小鼠的成骨細(xì)胞成熟和向骨細(xì)胞分化嚴(yán)重受阻[4-6]。這些結(jié)果提示，Osterix無論在胚胎期還是出生后的骨發(fā)育和骨成熟中起到重要作用。鑒于Osterix在成骨中的重要作用，筆者通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠觀察了其在調(diào)控腰椎骨量中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Osterix過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠骨量無明顯變化，而Osterix敲除小鼠腰椎骨量明顯增加，提示Osterix在調(diào)控小鼠腰椎骨量中起到不可或缺的重要作用。

由于成骨和破骨之間的平衡決定最終的骨量的多少，而有研究已經(jīng)證實(shí)Osterix敲除小鼠的成骨能力明顯低于野生型小鼠[4-6]。因此，筆者進(jìn)一步觀察了Osterix敲除小鼠的破骨細(xì)胞的活性和數(shù)量變化情況，TRAP染色結(jié)果顯示，Osterix敲除小鼠脊椎中破骨細(xì)胞數(shù)量明顯下降。因而在Osterix敲除小鼠中，其成骨和破骨能力均下降，但后者下降的更明顯，導(dǎo)致總的效應(yīng)為骨量增加。

在破骨細(xì)胞成熟的過程中，成骨細(xì)胞等分泌RANKL調(diào)節(jié)其成熟[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，Osterix敲除小鼠脊柱中RANKL的表達(dá)水平明顯下調(diào)，這是導(dǎo)致破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯降低的原因。而破骨細(xì)胞數(shù)量的減少，導(dǎo)致成骨與破骨之間的平衡被打破，引起Osterix敲除小鼠脊椎中骨量增加。

綜上所述，Osterix在調(diào)控脊椎骨量中起到重要作用，其主要的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞之間的平衡得以實(shí)現(xiàn)。而Osterix在調(diào)節(jié)脊椎骨量的過程中與其他信號通路之間的相互作用關(guān)系需要進(jìn)一步觀察，以更好為治療骨質(zhì)疏松提供好的線索。

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