劉 新 韋新桂 高宇輝 王 恒

1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院， 北京 100005)2(北京韋氏博慧色譜科技有限公司， 北京 100176)

惡性瘧原蟲多表位人工隨機(jī)重組疫苗M.RCAg-1的中試規(guī)模制備與鑒定

劉 新1韋新桂2高宇輝1王 恒*

1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院， 北京 100005)2(北京韋氏博慧色譜科技有限公司， 北京 100176)

中試規(guī)模高效制備惡性瘧原蟲多表位人工隨機(jī)重組疫苗M.RCAg-1，并對其免疫原性進(jìn)行鑒定。20 L培養(yǎng)基規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)M.RCAg-1的工程菌，產(chǎn)物經(jīng)高壓勻漿破碎后，通過鎳瓊脂糖凝膠FF層析和瓊葡糖凝膠G200 HP層析兩步分離純化獲得中試M.RCAg-1。將15只BALB/c小鼠隨機(jī)地平均分為3組(弗氏佐劑組、中試M.RCAg-1與弗氏佐劑配伍組和小試M.RCAg-1與弗氏佐劑配伍組)進(jìn)行皮下免疫，利用間接Elisa和間接免疫熒光(IFA)技術(shù)對3次免疫后小鼠血清中的特異性抗體進(jìn)行分析。IPTG誘導(dǎo)4 h后發(fā)酵結(jié)束，菌體產(chǎn)量25 g/L，M.RCAg-1約占菌體總蛋白的24%；經(jīng)兩步柱層析分離純化后，目的蛋白純度大于95%，回收率高達(dá)53.2%；與弗氏佐劑對照組相比，中試M.RCAg-1和小試M.RCAg-1都能在小鼠體內(nèi)誘生高水平的特異性抗體應(yīng)答，其抗體滴度均可達(dá)到1∶1 024 000。與此同時(shí)，兩實(shí)驗(yàn)組鼠血清抗體的對瘧原蟲天然抗原都有識別，其識別水平并無差異(P>0.05)。本研究成功地高效制備出多表位人工隨機(jī)重組疫苗M.RCAg-1，并在小鼠體內(nèi)證實(shí)其具有良好的免疫原性，為隨后進(jìn)行的M.RCAg-1的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

惡性瘧原蟲；蛋白疫苗；中試發(fā)酵；免疫原性

引言

瘧疾與結(jié)核病、艾滋病并稱為世界三大傳染病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。WHO最新數(shù)據(jù)顯示，2012年全球有627 000人因感染瘧疾而死亡，意味著平均每天有超過1 700人被瘧疾奪去生命。由于耐藥性瘧原蟲蟲株和抗殺蟲劑按蚊的出現(xiàn)及擴(kuò)散，使得傳統(tǒng)預(yù)防和治療瘧疾的方法面臨威脅[1]。

瘧原蟲的生活史極為復(fù)雜，其先后在人和按蚊兩個(gè)宿主的5個(gè)組織內(nèi)發(fā)生10次形態(tài)改變，而每個(gè)形態(tài)都會(huì)有其特異性抗原表達(dá)；加之瘧原蟲抗原具有高度變異性，以及缺乏高效的佐劑、合適的疫苗遞送系統(tǒng)和檢測疫苗效力的動(dòng)物模型，令瘧疾疫苗的研制困難重重，以致目前全球尚無被批準(zhǔn)使用的瘧疾疫苗[2]。惡性瘧原蟲在誘發(fā)人類瘧疾的5種瘧原蟲中致死率最高，紅內(nèi)期是惡性瘧疾唯一致病和發(fā)病的階段，因此研究針對紅內(nèi)期瘧原蟲的疫苗，對降低瘧疾的死亡率和減少并發(fā)癥意義重大。迄今為止，已有50 余種惡性瘧原蟲紅內(nèi)期疫苗候選抗原被鑒定出來，但由于這些抗原單獨(dú)或聯(lián)合作為候選疫苗使用時(shí)，對瘧原蟲蟲株及人群覆蓋率較低，導(dǎo)致其免疫效果并不理想。為彌補(bǔ)這一不足，強(qiáng)化疫苗的免疫保護(hù)效果并延長免疫作用時(shí)間，多抗原多表位重組蛋白疫苗，成為目前瘧疾疫苗研究的重點(diǎn)[3]。此外，由美國國家過敏癥和傳染病研究所研制的減毒子孢子疫苗pfSPZ，一種以多次靜脈注射方式接種人群的全蟲疫苗，在臨床實(shí)驗(yàn)中取得良好的保護(hù)效果[4]，進(jìn)一步為多抗原多表位疫苗的優(yōu)越性提供了可信依據(jù)。本課題組前期利用表位改組技術(shù)構(gòu)建了多種惡性瘧原蟲紅內(nèi)期多表位人工隨機(jī)重組蛋白疫苗，并從中篩選出了免疫原性最強(qiáng)及抗體體外抑制瘧原蟲生長效果最佳的M.RCAg-1疫苗[5-6]。

前期工作中，已經(jīng)構(gòu)建了能高效表達(dá)M.RCAg-1的工程菌，并對工程菌的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化[7]。本研究主要探索M.RCAg-1的工程菌20 L規(guī)模的中試發(fā)酵和純化工藝，并對中試蛋白的免疫原性進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1工程菌菌株

惡性瘧原蟲多表位人工隨機(jī)重組蛋白工程菌BL21(DE3)-M.RCAg-1/pDS-eX，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級、6～8周齡、雌性、BALB/c小鼠(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為3組，每組5只，苦味酸標(biāo)記。

1.1.3主要試劑及儀器

Trypton和Yeast extract(BD公司, 美國)，卡那霉素(GibcoTM公司，美國)，IPTG(Merck公司,德國), Imidazole、弗氏完全與不完全佐劑(Sigma公司, 美國)，辣根過氧化氫酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)，鎳瓊脂糖凝膠FF和瓊葡糖凝膠G200 HP填料(北京韋氏博慧色譜科技有限公司，中國)，高壓勻漿機(jī)(NS3015，GEA Niro Soavi公司，意大利)，30 L發(fā)酵罐(BLBIO-30SJ，上海百侖生物科技有限公司，中國)，KTA FPLC(UPC-900，Amersham公司，美國)，ELISA酶標(biāo)儀(Wellsacn MK3, Labsystems Dragon公司, 美國)，激光共聚焦顯微鏡(DM4000B，Leica公司，德國)。

1.2方法

1.2.130 L發(fā)酵罐中試發(fā)酵

挑取單克隆菌落接種到5 mL LB培養(yǎng)基(含卡那霉素100 mg/L)中，37℃振蕩培養(yǎng)8 h，按l：1 000接種量接種到的l L LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g)中，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，將30 L發(fā)酵罐空罐滅菌后加入20 L中試培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO4·3H2O 8g/L，KH2PO43g/L)中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，冷卻后將一級種子1 L接種到發(fā)酵罐中。根據(jù)pH反饋調(diào)節(jié)自動(dòng)控制補(bǔ)料速度，補(bǔ)料的碳源為葡萄糖(300 g/L)，氮源為氨水。發(fā)酵參數(shù)控制：溫度37℃，pH=7，溶氧≥30%。0D600值達(dá)到10左右時(shí)，加IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后離心收集菌體。按100 g濕菌體加l L PBS(0.01 mol/L，pH=8.0)，高壓勻漿破碎菌體(700 bar)，4℃，8 000 r/min離心30 min，收集上清。

1.2.2親和層析

1.2.3凝膠過濾層析

將經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠FF柱洗脫后的樣品上樣，用50 mMPBS緩沖液平衡過的瓊葡糖凝膠G200 HP層析柱(規(guī)格：XK26 mm×30 cm)，流速3 mL/min。再用同樣的流速和緩沖液洗脫，見峰收集洗脫液，留樣。對每步純化后的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行12%普通SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后再用凝膠成像系統(tǒng)拍照，蛋白純度分析軟件Gel-PRO Analyzer4.0分析目的蛋白質(zhì)純度。

1.2.4Western Bloting檢測目的蛋白

蛋白樣品經(jīng)BCA法定量后，進(jìn)行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后開始濕法轉(zhuǎn)膜，在冰浴的電轉(zhuǎn)槽中200 mA恒流電轉(zhuǎn)移2 h后，當(dāng)凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到PVDF膜上后，將PVDF膜放在含有5%脫脂奶粉的PBST中室溫慢搖封閉1 h，再用封閉液配制I抗溶液(1∶2 000)4℃搖勻過夜，I抗為抗M.RCAg-1特異性雞IgY；次日，先用PBST洗膜5次， 15 min/次， 再將PVDF膜轉(zhuǎn)至用封閉液配制HRP標(biāo)記的II抗溶液中(1∶20 000)室溫慢搖1 h；之后用PBST洗膜5次，15 min/次。暗室中將ECL試劑盒中的A液和B液各稀釋10倍后等體積混合，滴加于膜上，壓片，曝片。

1.2.5免疫BALB/c小鼠

PBS稀釋蛋白原液至所需濃度。弗氏佐劑與抗原蛋白按體積比1∶1混合，用乳化振蕩器冰上混勻，當(dāng)乳液滴入水中不散開后方可使用。首次免疫為完全弗氏佐劑，后兩次為不完全弗氏佐劑。各組小鼠每只免疫劑量20 μg /100 μL。全部腹部皮下注射，共免疫3次，每次間隔兩周。第3次免疫后10 d眼球取血。

1.2.6間接Elisa分析

用包被液稀釋M.RCAg-1至10 μg/mL，100 μL/孔包被于96酶標(biāo)板,包被的酶標(biāo)板經(jīng)含有3%羊血清的PBS(pH=7.4)封閉后，加入用封閉液倍比系列稀釋后的免疫鼠血清，37℃作用2 h；再用封閉液配制二抗(山羊抗鼠IgG抗體)溶液(1∶10 000)，37℃作用1 h。利用TMB顯色系統(tǒng)，100 μL/孔，室溫放置10 min。1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，50 μL/孔。用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光度值。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組吸光度值大于對照組吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)差+2 SD時(shí)判為陽性。

1.2.7間接免疫熒光分析

將感染率5%左右惡性瘧原蟲3D7株紅內(nèi)期混合期細(xì)胞均勻涂于載玻片上，室溫風(fēng)干。用固定液(甲醇∶丙酮=1∶4)固定10 min后，室溫風(fēng)干。加入不同稀釋度的一抗血清37℃濕盒內(nèi)孵育1 h或4℃過夜(免疫前鼠血清作為陰性對照)。用PBS沖洗3次，每次10 min，風(fēng)干。加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃，濕盒內(nèi)1 h。用PBS洗3次，每次10 min，風(fēng)干。立刻用熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.130L發(fā)酵罐中試發(fā)酵

發(fā)酵產(chǎn)物的12%SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1所示(M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為未誘導(dǎo)的菌液；2～5分別是IPTG誘導(dǎo)1～4 h后的發(fā)酵液上清；6～7分別是高壓勻漿破碎菌體上清和沉淀)。IPTG誘導(dǎo)1 h后，目的蛋白開始表達(dá)，3 h以后M.RCAg-1表達(dá)量變化不大。誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后離心收集菌體，濕重約500 g(25 g/L)，目的蛋白表達(dá)量為24%左右。高壓勻漿破碎發(fā)酵后菌體，M.RCAg-1在上清中含量的高于沉淀中，表明其在大腸桿菌中為可溶性表達(dá)。

2.2發(fā)酵產(chǎn)物的純化

低溫離心收集破碎菌體上清并進(jìn)行純化，各步純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析如圖2所示(M為 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為鎳柱上樣，2為鎳柱穿透，3～7分別代表50、100、200、300、400 mM咪唑洗脫結(jié)果，8為中試規(guī)模親和層析純化后樣品，9為中試規(guī)模凝膠過濾后樣品)。

鑒于M.RCAg-1含有6×His標(biāo)簽，本研究首先選用鎳瓊脂糖凝膠FF進(jìn)行純化。在中試工藝放大前的摸索階段，用不同濃度的咪唑溶液進(jìn)行階段洗脫，結(jié)果如圖2中的lane3～lane7所示。發(fā)現(xiàn)300 mM咪唑洗脫出的目的蛋白純度和回收率最高，因而選用300 mM咪唑溶液作為中試規(guī)模親和層析的洗脫液。中試規(guī)模親和層析洗脫圖譜如圖3所示，P為300 mM咪唑洗脫出的目的蛋白的吸收峰。 圖2中的lane8為于該洗脫峰收集的樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果，可見雜蛋白的分子量主要在25 kDa和35 kDa處，凝膠軟件分析此時(shí)目的蛋白的純度為82.3%。為進(jìn)一步精細(xì)分離純化，將親和層析的產(chǎn)物上樣于瓊葡糖凝膠G200 HP層析柱，凝膠過濾洗脫圖譜如圖4所示(P1為目的蛋白吸收峰，P2～P4為雜蛋白的吸收峰)。于P1峰收集的樣品的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2中l(wèi)ane9所示。

按照上述M.RCAg-1的中試純化流程，連續(xù)制備出3批目的蛋白，BCA法測量每批目的蛋白的濃度為0.75 mg/mL左右，凝膠分析軟件分析蛋白樣品純度大于95%，計(jì)算中試規(guī)模純化出的M.RCAg-1的總回收率為53.2%左右(見表1)。

2.3Westernblotting驗(yàn)證純化后蛋白

圖5所示是對中試規(guī)模純化出的蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE和Western blotting分析鑒定結(jié)果(圖中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1和2分別代表上樣量為2.5和5 μg的中試規(guī)模純化出的蛋白樣品)。Western blotting結(jié)果顯示，中試純化出的蛋白能被M.RCAg-1特異性抗體識別，說明該純化蛋白是目的蛋白并具有很好的反應(yīng)原性。

2.4中試M.RCAg-1免疫原性分析

將中試規(guī)模制備的M.RCAg-1(中試M.RCAg-1)和實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模制備的M.RCAg-1(小試M.RCAg-1)分別與弗氏佐劑配伍免疫BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，以單獨(dú)免疫弗氏佐劑組作為對照組，間接Elisa法檢測3次免疫后各組鼠血清中的特異性抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，中試M.RCAg-1和小試M.RCAg-1都能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生高水平的針對M.RCAg-1的特異性抗體免疫應(yīng)答，其血清抗體滴度相同都可達(dá)到1∶1 024 000(見圖6)。間接免疫熒光結(jié)果顯示，兩實(shí)驗(yàn)組鼠血清抗體的IFA識別滴度都達(dá)到了1∶1 600左右(見圖7)，說明兩組血清抗體對瘧原蟲天然蟲體蛋白識別水平相同。

3 討論

本課題組前期構(gòu)建的多表位人工隨機(jī)重組蛋白疫苗M.RCAg-1，包含了8個(gè)瘧原蟲抗原(MSP-1、RESA、EBA-175、AMA-1、MAg-1， LSA-1，CS.T3 /CSP和NKND)的11個(gè)Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位。并在BALB/c小鼠、新西蘭兔和非人靈長類動(dòng)物模型中證實(shí)，M.RCAg-1具有極好的免疫原性、免疫保護(hù)性和安全性，是一個(gè)很有開發(fā)價(jià)值的瘧疾候選疫苗。

本研究在對M.RCAg-1工程菌進(jìn)行20 L規(guī)模的中試發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格控制發(fā)酵液溶氧在30%～50%之間、pH在7.0左右，對發(fā)酵成功十分必要。不適的pH會(huì)使菌體細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，影響大腸桿菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，從而抑制其生長。溶氧水平偏高會(huì)產(chǎn)生氧中毒現(xiàn)象，偏低會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)行無氧代謝產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物，不僅抑制菌體生長，還會(huì)降低目的蛋白的表達(dá)量[8]。此外，據(jù)報(bào)道許多工程菌外源性蛋白的表達(dá)形式，都與其發(fā)酵培養(yǎng)條件相關(guān)，這些條件包括培養(yǎng)基、pH值、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等等，但在對M.RCAg-1工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，M.RCAg-1始終以可溶性形式表達(dá)。與目前多種重組蛋白候選疫苗的包涵體表達(dá)形式不同[9-12]，目的蛋白的可溶性表達(dá)，避免了包涵體復(fù)性工藝的難度系數(shù)大、工作量大、目的蛋白回收率低等缺點(diǎn)[13]，極大地減輕了后續(xù)純化工藝的負(fù)擔(dān)。

中試純化策略，是影響M.RCAg-1高效制備的關(guān)鍵因素。本課題組前期按照“高壓勻漿破菌→熱沉淀→Q Sepharose XL→Source30 Q→Superdex 200”的純化策略(未發(fā)表)，得到了純度大于95%的目的蛋白，但其回收率只有5%，遠(yuǎn)不能滿足臨床試驗(yàn)的需求。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，熱沉淀和兩步陰離子交換層析目的蛋白的損失量最大，原因是M.RCAg-1具有熱不穩(wěn)定性，熱沉淀(55℃、30 min)一步雖然對雜蛋白的去除和蛋白酶的滅活效果很好， 可是也會(huì)導(dǎo)致部分目的蛋白穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞進(jìn)而降低其回收率。與此同時(shí)，作為人工隨機(jī)重組蛋白，M.RCAg-1的結(jié)構(gòu)較松散，各表位具有高度親水性，盡管兩步陰離子交換層析的純化效果不錯(cuò)，但較長的耗時(shí)及其較強(qiáng)烈的離子間作用力，都會(huì)導(dǎo)致M.RCAg-1發(fā)生降解；一方面降低了目的蛋白的回收率，另一方面降解后的片段干擾了下游純化流程。所以本研究在對M.RCAg-1進(jìn)行純化的過程中始終保持低溫操作，同時(shí)改進(jìn)純化策略，選用載量大、流速快、特異性較強(qiáng)的鎳瓊脂糖凝膠FF層析柱進(jìn)行初步純化。經(jīng)不同濃度的咪唑溶液階段洗脫，發(fā)現(xiàn)300 mM咪唑洗脫出的目的蛋白純度和回收率最高，因此使用300 mM咪唑溶液作為親和層析放大工藝的洗脫液。一步純化后，目的蛋白純度可達(dá)82.3%。接下來選用樹脂顆粒小、基質(zhì)分辨率高的瓊葡糖凝膠G200 HP層析柱進(jìn)行精細(xì)分離純化，也可將高咪唑溶液體系更換成能使M.RCAg-1穩(wěn)定存在的PBS溶液體系。按照上述優(yōu)化后的純化策略，連續(xù)制備出的3批中試蛋白的純度均高于95%，回收率達(dá)53.2%。目的蛋白回收率的顯著提高，提示我們對于類似結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定的人工隨機(jī)重組多表位蛋白的純化，應(yīng)從其理化性質(zhì)著手，選擇合適的層析柱，盡可能簡化純化步驟，防止目的蛋白發(fā)生降解干擾純化流程。此外，為保持M.RCAg-1的構(gòu)象穩(wěn)定性及其生物學(xué)活性，本課題組正在探索能使其穩(wěn)定存在并滿足臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)的溶液體系，相信這個(gè)體系一旦建立，M.RCAg-1的純度和回收率會(huì)進(jìn)一步提高。

本課題組前期已在BALB/c小鼠動(dòng)物模型中證實(shí)實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備的M.RCAg-1具有很好的免疫原性[14]。本研究將中試規(guī)模制備的M.RCAg-1和實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模制備的M.RCAg-1分別與弗氏佐劑配伍免疫BALB/c小鼠，并利用間接Elisa和間接免疫熒光技術(shù)對各組3次免疫后血清中的特異性抗體進(jìn)行分析。結(jié)果表明與小試M.RCAg-1實(shí)驗(yàn)組相比，中試M.RCAg-1也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生相同水平的針對M.RCAg-1抗原的特異性抗體應(yīng)答(見圖6)，并且誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體對惡性瘧原蟲3D7蟲株天然蟲體蛋白的識別水平也與小試M.RCAg-1相同(見圖7)，進(jìn)而說明中試規(guī)模制備的M.RCAg-1具有很好的免疫原性。

4 結(jié)論

本研究成功地進(jìn)行了M.RCAg-1中試規(guī)模的發(fā)酵和純化，得到了純度高于95%、回收率高達(dá)53.2%的目的蛋白，并證實(shí)該中試蛋白具有良好的免疫原性，為隨后進(jìn)行的M.RCAg-1臨床前試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，也為類似多表位人工隨機(jī)重組疫苗的大量制備提供了技術(shù)借鑒。

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Pilot-ScaleProductionandIdentificationofPlasmodiumFalciparumMultiepitopeRandomConstructedVaccineM.RCAg-1

LIU Xin1WEI Xin-Gui2GAO Yu-Hui1WANG Heng1*

1(InstituteofBasicMedicalSciences，ChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicine,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)2(BeijingWeishibohuiChromatographyTechnologyCo.,Ltd,Beijing100176,China)

The aim of this work is to producePlasmodiumfalciparummultiepitope random constructed vaccine M.RCAg-1 efficiently in pilot scale and identify its immunogenicity. M.RCAg-1 producingE.coliwas fermented in 20 L culture. After the fermentation products were homogenized by high pressure, the obtained bacteria lysate was purified by Ni FF affinity chromatography and G200 HP gel filtration chromatography. Fifteen BALB/c mice were randomly divided into three groups (the group of Freund’s adjuvant, the group of pilot-scale M.RCAg-1 combined with Freund’s adjuvant and the group of lab-scale M.RCAg-1 combined with Freund’s adjuvant) and injected subcutaneously. The serum of these mice was collected after third immunization to analyze the specific serum antibody by indirect ELISA and indirect immunofluoreseence assay (IFA) technology. Fermentation process was finished after 4 h induced by IPTG. The collected wet cell yield was 25 g/L, and the expression level of M.RCAg-1 was about 24%. After two-step purification, the final M.RCAg-1 was over 95% in purity，the yield was 53.2%．Compared with the control group, both the pilot-scale and lab-scale M.RCAg-1 induced high level antibody response in mice and the antibody titter was 1∶1 024 000. At the same time, serum antibody of the two experimental groups recognized the natural antigen ofPlasmodiumfalciparumvery well and there was no difference of recognition between the two groups(P>0.05). With the successful production ofPlasmodiumfalciparummultiepitope random constructed vaccine M.RCAg-1 efficiently in pilot scale and the confirmation of its good immunogenicity in mouse model, this study provids the foundation for pre-clinic study of M.RCAg-1.

plasmodiumfalciparum；protein vaccine；pilot scale fermentation；immunogenicity

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 03.010

2014-02-20， 錄用日期:2014-05-04

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863計(jì)劃) (2012AA02A406)

R318

A

0258-8021(2014) 03-0329-06

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: wanghpumc@gmail.com