黃圣良 程玉蘭 馬翰斐

雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊對大鼠骨質疏松性骨折骨愈合影響的實驗研究*

黃圣良①程玉蘭①馬翰斐①

目的：通過觀察雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊對骨質疏松性骨折愈合的影響，以探討中西醫(yī)結合治療骨質疏松性骨折的意義。方法：30只SD大鼠給予維甲酸灌胃，制造骨質疏松性骨折模型成功后，按隨機數(shù)字表分為實驗組和對照組，每組15只。實驗組給予雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊灌胃，對照組給予生理鹽水灌胃，于2周、4周和6周處死實驗鼠，進行骨痂大小的測量及組織學研究。結果：2周時兩組骨痂大小比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4周時實驗組骨痂大小較對照組小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；6周時實驗組骨痂大小明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。2周時組織學檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組成骨細胞數(shù)目較對照組無明顯增多；4周及6周時則明顯增多。結論：雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊治療維甲酸所致大鼠骨質疏松性骨折療效顯著。

骨質疏松； 大鼠； 骨折愈合； 雷尼酸鍶； 強骨膠囊

骨質疏松癥（osteoporosis）是一種以單位體積內(nèi)骨量減少、骨小梁數(shù)目減少、骨皮質變薄、骨組織微細結構破壞、骨髓腔增寬、骨脆性增加及骨折危險幾率增加為特征的骨骼綜合性疾病。骨折是骨質疏松癥最嚴重后果，且發(fā)生骨折后相較正常愈合緩慢。強骨膠囊和雷尼酸鍶是臨床治療骨質疏松的常用中藥和西藥，兩藥合用能否更促進骨質疏松性骨折愈合，國內(nèi)外少有報道。本研究通過建立SD大鼠骨質疏松性骨折的模型，觀察雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊對骨質疏松性骨折愈合的影響，探討中西藥結合治療骨質疏松性骨折的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇5個月齡雌性SD大鼠30只，體質量215～235 g。

1.2 方法

1.2.1 骨質疏松模型的制作 對30只未交配過的健康成年雌性SD大鼠進行造模，給予維甲酸80 mg/（kg·d）灌胃，共15 d。將30只骨質疏松造型成功的SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組各15只。

1.2.2 SD大鼠骨質疏松性骨折模型的建立 確定骨質疏松SD大鼠模型建立成功后，兩組SD大鼠用同樣的方法進行腹腔注射麻醉，麻醉效果滿意后，在無菌條件下，隨機選一側股骨，暴露股骨干，在股骨中段行橫行截骨，制作橫行骨折模型，然后通過成人掌指骨微型接骨板內(nèi)固定，固定效果良好后，逐層縫合包扎傷口。術后給予腹腔內(nèi)注射抗生素，預防感染，然后將SD大鼠放回飼養(yǎng)籠中，自由活動，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 給藥方法和劑量 自骨質疏松性骨折后第1天開始，實驗組每只SD大鼠按雷尼酸鍶400 mg/（kg·d）+強骨膠囊90 mg/（kg·d）灌胃；對照組給予同體積生理鹽水灌胃，共6周。

1.2.4 骨痂大小測量 通過PACS采集系統(tǒng)對骨痂大小進行測量，對患側股骨骨痂最寬處及相應健側股骨同一水平骨干寬度進行測量。用患側寬度數(shù)據(jù)除以健側寬度數(shù)據(jù)，得到相對數(shù)。用寬度的相對數(shù)進行統(tǒng)計學分析。

1.2.5 病理組織學檢查 分別于2、4、6周對實驗SD大鼠用腹腔內(nèi)注射水合氯醛8 mL/kg的方法處死，解剖分離出股骨，立即用甲醛溶液（pH=7.4）浸泡并固定；24 h后取出用10%EDTA（pH=7.4）脫鈣液浸泡并持續(xù)脫鈣3～5周；10%EDTA（pH=7.4）脫鈣液每5～7天進行更換，用針刺檢測脫鈣效果滿意后，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切5 μm片，HE常規(guī)染色，Nikon E700型顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SAS 9.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組骨質疏松模型BMC值比較 對照組BMC平均值為（0.1286±0.0034）g/cm2，實驗組為（0.1194±0.0040）g/cm2，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.026），維甲酸SD大鼠骨質疏松制造模型成功。

2.2 兩組影像學分析 根據(jù)X線片觀察可見實驗組相比對照組骨痂形成較小，4周時未發(fā)現(xiàn)骨折線，骨痂開始塑形，骨髓腔已經(jīng)開始貫通；6周時骨折愈合，骨折端骨髓腔完全貫通，骨痂塑形已經(jīng)接近完成。對照組在4、6周時，骨折端仍清晰可見；且4周時，對照組骨折線較實驗組清晰，骨痂較實驗組肥大，見圖1～4。

圖1 對照組X線片（4周）

圖2 實驗組X線片（4周）

圖3 對照組X線片（6周）

圖4 實驗組X線片（6周）

2.3 兩組骨痂大小相對數(shù)的比較 2周時兩組骨痂大小相對數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4周時實驗組骨痂大小相對數(shù)較對照組小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；6周實驗組骨痂大小相對數(shù)明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

表1 兩組骨痂大小相對數(shù)的比較（±s）

表1 兩組骨痂大小相對數(shù)的比較（±s）

組別 2周 4周 6周實驗組（n=15） 2.31±0.12 2.65±0.27 2.12±0.11對照組（n=15） 2.32±0.14 2.98±0.31 2.65±0.22

2.4 病理組織學檢查 2周時組織學檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組成骨細胞數(shù)目較對照組無明顯增多；4周及6周時實驗組成骨細胞數(shù)目較對照組明顯增多，見圖5～6。

圖5 對照組病理組織學圖像（4周）

圖6 實驗組病理組織學圖像（4周）

3 討論

骨折愈合是破骨細胞和成骨細胞聯(lián)合作用的結果，早期破骨細胞可以清除死骨，中晚期破骨細胞使骨痂上形成陷窩，成骨細胞附著在陷窩上，隨后成骨細胞可產(chǎn)生新的骨單位，如此完成骨痂塑形過程。

雷尼酸鍶是具有雙重作用的新型的抗骨質疏松藥。與其他藥物不同，雷尼酸鍶可誘導骨重建及解偶聯(lián)，具有刺激骨形成、抑制骨吸收的雙重作用，能增加骨的密度及強度，但對骨基質的礦化無影響，不改變骨的晶體結構，從而有效降低骨折風險。雷尼酸鍶調(diào)控骨量的機制還不是很清楚，但可能是通過鈣敏感受體發(fā)揮作用，一方面，雷尼酸鍶通過鈣敏感受體，促進I型膠原的合成和加速骨基質礦化，促進前成骨細胞增殖及向成骨細胞分化；另一方面，通過鈣敏感受體抑制破骨前體細胞分化、成熟及促進破骨細胞凋亡，從而降低破骨細胞活性，降低骨骼的吸收。在體外，雷尼酸鍶可通過增加OPG/RANK比值濃度的依賴性，上調(diào)成骨細胞的表達，從而達到抑制骨吸收和促進骨形成的雙重效果[1]。有研究發(fā)現(xiàn)鈣敏感受體敲出可以使雷尼酸鍶對OPG和RANK的效應消失，故考慮在雷尼酸鍶對OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)影響中，鈣敏感受體起介導作用[2]。鍶可通過鈣敏感受體介導，激活磷脂酶c和核轉錄因子KB，促進成熟破骨細胞的凋亡，與鈣有所不同的是鍶誘導破骨細胞凋亡與PKCβⅡ的活化相關，不依賴于三磷酸肌醇[3]。由于鍶和鈣發(fā)揮作用的細胞內(nèi)信號通道不完全相同，兩者聯(lián)合使用可共同促進成熟破骨細胞凋亡。此外，雷尼酸鍶可增加鈣敏感受體基因敲除小鼠成骨細胞數(shù)量，小鼠的成骨細胞可能含有不同于鈣敏感受體的其他陽離子感應受體，提示雷尼酸鍶通過不僅僅通過鈣敏感受體起作用，而是可以通過不同的信號通路影響破骨細胞、成骨細胞發(fā)揮不同功能[4]。有研究發(fā)現(xiàn)鍶可減少原代培養(yǎng)的成骨細胞硬骨素表達，從而通過影響wnt信號通路促進骨形成，還可以抑制氧化應激從而發(fā)揮抗骨質疏松的作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，用雷尼酸鍶處理從小鼠顱骨細胞分離出原代成骨細胞可使骨鈣化結節(jié)濃度增加，能促進從骨祖細胞到成熟骨細胞等不同階段的成骨細胞分化成熟，表現(xiàn)為ALP、骨鈣素和骨唾液酸蛋白等成骨細胞標志物表達增加[7]。鍶還可增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的表達，誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化。除成骨細胞作用外，雷尼酸鍶可使破骨細胞數(shù)量減少和Trap活性降低，促進破骨細胞凋亡，抑制破骨細胞分化。有研究證實雷尼酸鍶在預防脊柱骨折和非脊柱骨折（包括髖部骨折）方面均有效[8]。

強骨膠囊主要有效成分為骨碎補（Drynariae rhizoma），骨碎補是骨傷科最常用中藥，具有續(xù)傷、止痛、補腎強骨等作用，臨床上常用于治療各種骨關節(jié)炎和骨質疏松癥等[9]。骨碎補含有總黃酮和柚皮苷物質，總黃酮可明顯減輕骨質疏松癥導致的骨密度下降，柚皮苷物質可改善動物脂質代謝。體外骨細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮能促進成骨細胞的增殖和活性，提高骨密度，增加骨形成，維持骨超微結構的完整[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，強骨膠囊可以明顯緩解骨質疏松癥患者的骨痛癥狀，應用強骨膠囊治療兩個療程后提高骨密度平均值6.2%，血清堿性磷酸酶、鈣水平也明顯增加[11-13]。此外，骨碎補總黃酮具有抑制炎癥反應的作用，可抑制巨噬細胞分泌各種細胞因子。含骨碎補總黃酮血清在腫瘤壞死因子ɑ介導的炎癥環(huán)境下可減少成骨細胞凋亡及誘導成骨細胞增殖[14]。韓國Jeong等[15-16]研究也證實，骨碎補具有抑制破骨細胞功能的作用，以及促進成骨前體細胞增殖、分化及成熟的作用。

本實驗從影像學分析發(fā)現(xiàn)，4周時實驗組骨痂小于對照組（P<0.05），骨折線模糊，6周時實驗組骨痂明顯小于對照組（P<0.05），表明雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊治療大鼠骨質疏松性骨折的愈合情況明顯好于對照組。組織學檢測也顯示雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊組成骨細胞較多，破骨細胞數(shù)量較少，有利于骨折愈合。

綜上所述，筆者認為骨質疏松性骨折早期可使用雷尼酸鍶聯(lián)合強骨膠囊以促進骨折愈合，方法簡單實用，值得臨床應用。

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Effect of Strontium Ranelate Combined with Qianggu Capsule on Fracture Healing in Rats Osteoporotic Model

HUANG Sheng-liang，CHENG Yu-lan，MA Han-fei.

The Longhua New District People’s Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518109，China

Objective： To explore the significance of treatment of combining traditional Chinese and western medicine on osteoporotic fracture， and to observe the effect of Strontium ranelate combined with Qianggu capsule on osteoporotic fracture healing. Method： 30 spragne-dawley rats were given with the retinoie acid intragastrically to induce osteoporosis.All rats with osteoporosis were randomly divided into the experimental group and the control group， each group had 15 rats， the experimental group and the control group were respectively given Strontium ranelate combined with Qianggu capsule and normal saline. The rats in each group were sacrificed at the second，fourth and sixth week respectively. Size of bony callus was measured and histopathologic features were analyzed.Result： There was no significant difference of the size of bony callus between two groups at the second week（P>0.05）. At the fourth week， the experimental group’s bony callus was smaller than the control group and there was significant difference between two groups（P<0.05）. At the sixth week， the experimental group’s bony callus was obviously smaller than the control group and there was significant difference between two groups （P<0.01）. At the second week， histological inspection found that compared with the control group， there was no significant increased of osteoblast number in the experimental group， but at the fourth week and the sixth week， there was significant increased. Conclusion：Strontium ranelate combined with Qianggu capsule has obviously curative effect on osteoporotic fracture rats caused by retinoie acid.

Osteoporosis； Rats； Fracture healing； Strontium ranelate； Qianggu capsule

Medical Innovation of China，2014，11（15）：033-037

廣東省深圳市寶安區(qū)2011年科技計劃項目（20110689）

①廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院 廣東 深圳 518109

黃圣良

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.012

2014-03-10） （本文編輯：蔡元元）