李容，梁榕珊，覃濤，黃鎖義

（右江民族醫(yī)學院，廣西百色533000）

天然多糖是一類結(jié)構(gòu)組成復雜的高分子化合物。研究發(fā)現(xiàn)，天然多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗輻射等多樣生物活性[1]，且對人體毒副作用小，在食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的用途。目前對天然多糖結(jié)構(gòu)和生物活性研究已成為國際研究的熱點。白茅根（Imperata Cylindrica），又名茅草根、地節(jié)根、甜草根等，為禾本科植物白茅Imperata cylindrica Beauv.var.major（Nees）C.E.Hubb.的干燥根莖[2]，具有涼血止血、清熱利尿、清熱生津、保肝等功效[3]。白茅根主要有三萜類、黃酮及色原酮類、木質(zhì)素類、糖類、有機酸類等多種化學成分，其中糖類是其主要的化學成分，含量占總提取物的80%以上[4]。目前，對白茅根多糖的研究基本集中在提取工藝和結(jié)構(gòu)分析方面，而多糖的藥理活性的相關(guān)研究較少。本實驗對白茅根多糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了研究，為多糖的開發(fā)利用、拓寬其應用途徑奠定理論參考。

1 儀器與材料

1.1 材料

白茅根（Imperata Cylindrica）產(chǎn)地廣西貴港市，購于百色市神康醫(yī)藥公司，經(jīng)右江民族醫(yī)學院民族醫(yī)學教研室覃道光副教授鑒定為禾本科植物白茅（Imperata cylindrica Beauv.var.major（Nees）C.E.Hubb.）的干燥根莖，低溫干燥至恒重后，粉碎過篩備用。

1.2 試劑

2，2′-連氨-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）：上海金穗生物科技公司；抗壞血酸（VC）：上海國藥化學試劑公司；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）：sigma 公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）：上海金穗生物科技公司；谷胱甘肽：上海國藥化學試劑公司；阿卡波糖：德國拜耳公司（批號117358），其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

FZ102 植物粉碎機：上海銳豐儀器儀表有限公司；MK3 酶標儀：塞默飛世爾科技有限公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機：上海比朗儀器有限公司；LRH-150 恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；3-18K 離心機：SIGMA 公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海安亭實驗儀器有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；CPA64 型電子天平：北京塞多利斯儀器公司；HHS-21-4 電熱式恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏凱儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

2 方法

2.1 白茅根多糖的制備

按文獻[5]的方法稍加改進提取分離白茅根多糖。取干燥的白茅根，粉碎過60 目篩，取500 g 過篩粉末，加入1 L 95%乙醇，在常溫下靜置24 h，再在50 ℃水浴中回流提取3 h，過濾，濾渣晾干，加入2 L 水90 ℃水浴中提取3 h，過濾收集濾液，濾渣再重復加水提取1 次，合并2 次濾液，減壓濃縮至200 mL，離心除去雜質(zhì)，在清液中加入95%乙醇進行醇沉，冰箱中靜置過夜，過濾，真空冷凍干燥得白茅根粗多糖。將得到的白茅根粗多糖溶解，加入Sevag 試劑（氯仿∶正丁醇=4 ∶1）脫蛋白，反復脫蛋白多次，直至無變性蛋白，收集水相，加入95%乙醇進行醇沉，冰箱中靜置過夜，過濾，冷凍干燥得精制多糖7.3 g。

2.2 白茅根抗氧化活性研究

2.2.1 總還原能力

[6-7]進行測定。取1 mL 多糖溶液，加入0.2 mol/L pH 6.6 的磷酸鹽緩沖溶液2 mL，1 %鐵氰化鉀2 mL，混合均勻后置50 ℃水浴中恒溫20 min，水浴后用冰水迅速冷卻，加入10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min 下離心10 min，取2 mL 上清液于試管，加入2 mL 蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵，搖勻后靜置10 min，測700 nm 處的吸光度。以VC為陽性對照，按相同的方法進行測定，實驗重復3 次，取平均值。

2.2.2 清除ABTS 自由基作用

參考霍麗妮[8]等方法進行測定。精密稱取ABTS 40 mg，用蒸餾水配制成濃度為7 mmol/L 的溶液，取5 mL ABTS 溶液與5 mL 濃度為2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液混合，室溫下避光放置16 h，用無水乙醇稀釋混合液，使其吸光度在734 nm 處為0.700 左右，即為ABTS+·儲備液。量取2 mL 多糖溶液與4 mL ABTS+·儲備液，混合避光靜置6 min，測吸光度值。以VC作為陽性對照，實驗重復3 次，取平均值，按下式計算清除率。式中：A0為不加多糖溶液的吸光度，A1為加入多糖溶液后的吸光度，A2為不加ABTS+·的吸光度，不加的體積均由蒸餾水補足體積。

2.2.3 清除羥基自由基作用

采用水楊酸法進行測定[9]。在試管中分別加入8 mmol/L FeSO41 mL、5 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液2 mL和不同濃度的白茅根多糖溶液2 mL，最后加入0.3%H2O21 mL 啟動反應，在室溫下反應0.5 h，測510 nm 處吸光度。以VC作為陽性對照，實驗重復3 次，取平均值，按下式計算清除率。式中：A0為不加多糖溶液的吸光度，A1為加入多糖溶液后的吸光度，A2為不加H2O2的吸光度，不加的體積均由蒸餾水補足體積。

2.3 白茅根多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性

對Tiabou[10]測定α-葡萄糖苷酶活性的方法進行改進，實驗分空白組、空白背景組、抑制劑組、抑制劑背景組，抑制劑為多糖和陽性對照阿卡波糖。在96 孔板中加入50 mmol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液50 μL，5 mmol/L 還原谷胱甘肽2.5 μL，3.3×10-5kat/L α-葡萄糖苷酶2.5 μL，分別加入不同濃度的抑制劑10 μL，混勻后在37 ℃的恒溫箱中恒溫10 min，加入20 mmol/L pNPG 5 μL，再置37 ℃的恒溫箱中恒溫10 min，加入0.1 mol/L Na2CO350 μL 終止反應，用酶標儀測定在405 nm 處的吸光度值?？瞻捉M不加抑制劑，空白背景組不加pNPG 和抑制劑，抑制劑背景組不加pNPG，均由蒸餾水補足體積，其他操作同抑制劑組。抑制劑對α-葡萄糖苷酶活性抑制率按下式計算，式中：A1為空白組吸光度值，A2為空白背景組吸光度值，A3為抑制劑組吸光度值，A4為抑制劑背景組吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 總還原能力

白茅根多糖和陽性對照物VC的總還原能力如圖1 所示。

一般來說，吸光度值越大，表明物質(zhì)的還原能力越強，即其抗氧化能力也越強。從圖1 可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，VC的還原能力隨其濃度的增大而增大，當濃度為0.5 mg/mL 時其吸光度值已大于1.400，濃度超過0.5 mg/mL 后吸光度值增大的幅度較小。白茅根多糖的還原能力與其濃度呈明顯的直線相關(guān)性，其線性相關(guān)系數(shù)r=0.997 6。白茅根多糖總還原能力明顯低于VC，但任有一定的還原能力。

圖1 白茅根多糖的還原能力Fig.1 Reducing power of polysaccharide from Imperata Cylindrica

3.2 清除ABTS 自由基結(jié)果

白茅根多糖和陽性對照物VC清除ABTS 自由基結(jié)果如圖2 所示。

圖2 白茅根多糖清除ABTS 自由基能力Fig.2 Scavenging ablility of polysaccharide from Imperata Cylindrica on ABTS+·

當多糖和VC濃度為0.05 mg/mL 時，其清除率分別為95.3%、80.6%。在實驗濃度范圍內(nèi)，VC和多糖對ABTS 自由基的清除率均與濃度呈直線相關(guān)性，VC和多糖的線性相關(guān)方程分別為Y=1783X+9.59、Y=1525X+4.53，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.986 0、0.997 1。用半抑制濃度IC50來衡量其清除能力的大小，IC50越小，其清除能力越強。VC和多糖的IC50分別為0.023、0.029 8 mg/mL，顯示出較好的清除效果。

3.3 清除羥基自由基結(jié)果

白茅根多糖對清除羥基自由基實驗結(jié)果如圖3所示。

白茅根多糖對羥基自由基的清除率隨濃度的增大而增大，當白茅根多糖濃度大于1 mg/mL 時，清除率大于50%。根據(jù)白茅根多糖的濃度（X）與清除率（Y），擬合得到回歸方程Y=34.146X+12.132，r=0.991 6，IC50為1.1 mg/mL。與相同濃度的陽性對照品Vc 相比，其清除羥基自由基能力低于VC。

圖3 白茅根多糖清除羥基自由基作用Fig.3 Scavenging ablility of polysaccharide from Imperata Cylindrica on·OH

3.4 白茅根多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性

α-葡萄糖苷酶抑制劑的顯著特點是能有效地阻止糖尿病患者餐后血糖升高，使血糖維持在一定水平，減少血糖對胰腺的刺激，能有效預防并改善糖尿病并發(fā)癥。以α-葡萄糖苷酶作為靶點，通過體外活性抑制試驗從中草藥中篩選具有治療糖尿病的有效成分已成為糖尿病治療藥物研究的熱點之一[11]。白茅根多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)構(gòu)如圖4 所示。

圖4 白茅根多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 The α-glucosidase inhibitory activities of polysaccharide from Imperata Cylindrica

白茅根多糖的抑制率較低，增大多糖濃度，抑制率增大的幅度并不大，甚至還有降低的趨勢，實驗中嘗試繼續(xù)增大多糖的質(zhì)量濃度，仍未出現(xiàn)明顯的抑制率增強。提示白茅根多糖并不能通過抑制α-葡萄糖苷酶活性來實現(xiàn)降血糖功效。

4 討論

白茅根是傳統(tǒng)的藥食同源中藥材，具有極大的藥用與食用價值。白茅根多糖是其重要的有效成分之一，研究表明白茅根多糖具有明顯提高小鼠耐缺氧能力作用[12]。因此，探明白茅根多糖的藥理活性，可拓寬其應用。

本實驗用總還原能力、清除ABTS 自由基、羥基自由基3 項指標來評價白茅根多糖的體外抗氧化活性，并與抗氧化劑VC進行比較。結(jié)果表明，白茅根多糖總還原能力低于VC，對ABTS 自由基的清除作用較強，接近VC，IC50為0.029 8 mg/mL，對羥基自由基也有一定的清除作用，IC50為1.1 mg/mL。本實驗評價白茅根多糖的抗氧化活性指標并不全面，在后續(xù)研究中應更加全面的探明其抗氧化活性。抑制α-葡萄糖苷酶活性實驗表明，白茅根多糖對α-葡萄糖苷酶并無明顯的抑制作用，提示其并不能通過抑制α-葡萄糖苷酶來實現(xiàn)降糖。

參考文獻：

[1] 劉姚,歐陽克蕙,葛霞,等.植物多糖生物活性研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2013,41(1):1-3

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:70

[3] 李水福.淺談畬藥白茅根的鑒別及開發(fā)利用[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2010(8):52-53

[4] 劉榮華,付麗娜,陳蘭英,等.白茅根化學成分與藥理研究進展[J].江西中醫(yī)學院學報,2010,22(4):80-83

[5] 鄒一可,張明月,王彩云,等.白茅根多糖IC1 的分離及其相對分子質(zhì)量和單糖組成的測定[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(2):80-82

[6] 尚曉婭,張媛,白艷寧,等.絞股藍多糖體外抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(4):450-454

[7] Lin C L,Wanf C C,Chang S C,et al.Antioxidative activity of polysaccharide fractions isolated from Lycium barbarum Linnaeus[J]. Int J Biol Macromol,2009,45(2):146-151

[8] 霍麗妮,廖艷芳,陳睿,等.狐貍尾不同極性溶劑提取物體外抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(23):155-158

[9] 梁鵬,甄潤英.辣木莖葉中水溶性多糖的提取及抗氧化活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2013,34(14):25-28

[10] Tiabou T A,Nahar K S,Fuendjiep V, et al.Alpha-Glucosidase inhibitors from Millettia conraui[J].Chemical and pharmaceutical Bulletin,2007,55(9):1402-1403

[11] 潘藝井,蔣文雯,聶昌平,等.7 種貴州民族藥材提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(2):385-388

[12] 孫立彥,劉振亮,孫金霞,等.白茅根多糖對小鼠耐缺氧作用的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2008,28(2):96-99