宋紅春 谷 雨 陸為民 耿燕楠

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029）

巴豆，系大戟科植物巴豆的種子，味辛，性熱。巴豆從很早之前就被用于抗腫瘤治療，巴豆制劑及其復(fù)方對胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤的治療作用已從化學(xué)、藥理、臨床等多方面研究確定。有實驗研究證實，巴豆生物堿（CA）能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[1-4]。本文即從體外實驗的角度，初步探討巴豆生物堿抑制SGC-7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的分子機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株 人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 藥物與試劑 巴豆生物堿由中國藥科大學(xué)藥理室制備；RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；免疫組化相關(guān)抗體試劑盒購自Bioworld公司；免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3 實驗儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板：Fisher Scientific公司（美國）；微量加樣器：Eppendorf公司（德國）；二氧化碳培養(yǎng)箱：3111型，Thermo公司（美國）；臺式離心機(jī)：80-2型，上海醫(yī)療器械 （集團(tuán)）有限公司；光學(xué)顯微鏡：LEICA DM-1000型，LEICA公司（德國）；MiniSee圖像采集系統(tǒng)：康克新柏圖文分析軟件。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞接種于含10%滅活小牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好，鋪滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶溶液常規(guī)消化、傳代。

2.2 免疫組化法檢測巴豆生物堿對SGC-7901細(xì)胞PCNA、Ki-67、Bax及Fas表達(dá)的影響 取處于對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，以2000μL每孔接種于6孔塑料板，6孔塑料板每孔底部交錯放置兩塊24mm×24mm經(jīng)多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入1000μL不同濃度的巴豆生物堿，使終濃度為 25、50、100、200、400μg/mL，并設(shè) 0μg/mL 的空白對照，每個濃度設(shè) 3 個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，取出蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛4℃固定過夜，3%H2O2室溫孵育20min，滴加一抗4℃過夜，次日滴加二抗，最后DAB顯色，蘇木素輕染，脫水，透明，封片。

每張細(xì)胞片選取6個不同視野在高倍鏡下觀察，以此來判斷細(xì)胞染色的著色率。PCNA和Ki-67陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)是以細(xì)胞核出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒沉著為陽性細(xì)胞，而Bax和Fas主要以胞漿出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒沉著為陽性細(xì)胞。染色結(jié)果以染色陽性細(xì)胞數(shù)百分比計算，即在觀察的高倍視野中，計數(shù)100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占百分比，并取6個視野的平均值。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗重復(fù)3次，結(jié)果以（x±s）表示。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

如圖1和圖2中所見，PCNA、Ki-67蛋白主要在胞核中表達(dá)，并隨著巴豆生物堿濃度的升高，PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)陽性率降低。如圖3和圖4中所見，Bax和Fas蛋白表達(dá)主要在胞漿中，隨著巴豆生物堿濃度的升高，Bax及Fas表達(dá)顯著增多。見表1。

圖1 免疫組化SGC-7901細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)（10×40）

圖2 免疫組化SGC-7901細(xì)胞中Ki-67蛋白的表達(dá)（10×40）

圖3 免疫組化SGC-7901細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)（10×40）

圖4 免疫組化SGC-7901細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)（10×40）

表1 各組SGC-7901細(xì)胞中PCNA、Ki-67、Bax、Fas蛋白表達(dá)陽性率（x±s） %

4 討論

目前，胃癌的治療仍以手術(shù)治療為主，聯(lián)合放化療，然而仍有部分患者不適宜手術(shù)，傳統(tǒng)化療藥物有嚴(yán)重的不良反應(yīng)和化療耐藥，多藥耐藥是造成腫瘤化療失敗的重要原因之一。因此，研究中藥對于腫瘤的作用，開發(fā)新型有效的抗腫瘤藥物具有廣闊的前景。近年來，生物堿類藥物在腫瘤防治方面的作用越來越受到人們的重視。

目前認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)。PCNA、Ki-67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，在增殖的細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，反映細(xì)胞的增殖活性，是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記物[5-6]。PCNA為S期廣泛表達(dá)的酸性蛋白，定位于細(xì)胞核，S期高水平表達(dá)，而在M期和G0期不表達(dá)。因此PCNA的陽性程度可直接反映DNA復(fù)制的活躍程度。Ki-67表達(dá)在G0期和G1早期缺如，在S、G2和M期等細(xì)胞中均有表達(dá)，其表達(dá)活性隨細(xì)胞周期進(jìn)展而增加，可準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖活性。本研究免疫組化結(jié)果顯示，隨著巴豆生物堿作用濃度的升高，SGC-7901細(xì)胞中PCNA、Ki-67表達(dá)下降，表明巴豆生物堿抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的作用機(jī)制與其下調(diào)PCNA、Ki-67表達(dá)相關(guān)，并呈濃度依賴性。腫瘤惡性程度與其細(xì)胞的增殖速度密切相關(guān)，細(xì)胞增殖活躍者，其生物學(xué)行為不佳，預(yù)后不良。巴豆生物堿可抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，表明其可一定程度地抑制胃癌的分化和轉(zhuǎn)移，改善預(yù)后。

細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種細(xì)胞自主的生理性死亡。細(xì)胞凋亡與機(jī)體清除病毒、抗腫瘤及腫瘤形成均有密切關(guān)系，Bcl-2家族蛋白和Fas/FasL系統(tǒng)是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子。根據(jù)在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類。bax是bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白，bax定位于細(xì)胞漿，自身可形成同源二聚體或與bcl-2形成異源二聚體。當(dāng)bax過度表達(dá)時，bax本身形成的同源二聚體占主導(dǎo)，則易于發(fā)生凋亡[7]。很多細(xì)胞凋亡中有bax表達(dá)升高，其能通過直接影響線粒體功能和膜的完整性而調(diào)節(jié)凋亡，并降低細(xì)胞凋亡的閾值[8]。bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)理主要有線粒體滲透性轉(zhuǎn)換、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破壞；細(xì)胞氧化還原作用改變；線粒體中的凋亡相關(guān)分子Apaf-1釋放出來，與細(xì)胞色素C相互作用，激活胱冬肽酶（caspase）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。有研究表明bax表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程呈負(fù)相關(guān)，bax在癌組織中的表達(dá)隨著病理分級、臨床分期的增高而降低，且bax在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中低表達(dá)[7]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，巴豆生物堿可調(diào)高SGC-7901細(xì)胞bax蛋白的表達(dá)，并呈濃度依賴性，表明巴豆生物堿可能通過上調(diào)bax的表達(dá)，促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌的發(fā)生與發(fā)展。

Fas是有關(guān)細(xì)胞凋亡的膜表面分子，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。FasL是Fas配體，屬于TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白。Fas一旦和其配體FasL結(jié)合，誘導(dǎo)Fas形成能傳遞信號的活性形式Fas三聚體，其中的死亡域可與一種死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白結(jié)合，并將凋亡信號傳遞給caspase-8，caspase-8的激活將產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。本實驗結(jié)果表明，隨著巴豆生物堿濃度的升高，SGC-7901細(xì)胞中Fas表達(dá)增多，表明巴豆生物堿能上調(diào)SGC-7901細(xì)胞Fas的表達(dá)，并呈濃度依賴性，說明巴豆生物堿誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與此相關(guān)。

胃癌的發(fā)生與發(fā)展受多基因、多途徑的調(diào)控，各種因素可協(xié)同或拮抗發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究從體外角度發(fā)現(xiàn)巴豆生物堿對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用與其下調(diào)PCNA、Ki-67表達(dá)及上調(diào)bax、Fas表達(dá)相關(guān)。這為我們進(jìn)一步研究巴豆生物堿抗腫瘤的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，并為臨床應(yīng)用提供了一定的依據(jù)，在胃癌的治療方面，巴豆生物堿可能成為一種有潛在應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。

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