王姍姍，周曉春，李秀秀，薛長湖，王靜鳳*

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致骨脆性和骨折危險性增高為特征的全身性骨骼疾病，其產(chǎn)生原因與骨重建過程中成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的平衡失調(diào)有關(guān)[1]。骨質(zhì)疏松癥已成為一個世界范圍內(nèi)越發(fā)嚴(yán)重的社會健康問題，據(jù)估計目前全世界患者人數(shù)已超過2 億，其發(fā)病率已躍居常見病、多發(fā)病的第7位。骨質(zhì)疏松癥患者預(yù)計到2050年將增加到2.2 億，其中 一半以上將發(fā)生在亞洲，絕大多數(shù)將在我國[2]。目前，市場上用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要包括雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙磷酸鹽類、降鈣素、氟制劑和VD及其活性代謝物類藥物等[3]，但長期服用具有較強(qiáng)的毒副作用，因此尋找安全有效的防治骨質(zhì)疏松癥的生物活性物質(zhì)已成為目前的研究熱點(diǎn)。

魚卵是水產(chǎn)加工的主要廢棄物之一[4]。它含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和多種維生素等，具有很高的營養(yǎng)價值[5]，但對魚卵的高值化加工利用主要集中在功能脂質(zhì)方面[6]。有關(guān)魚卵糖蛋白的研究主要集中在胚胎發(fā)育[7]、分離純化[8]、生化特性[9]、模式識別和作為污染標(biāo)志物等發(fā)育生物學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)方面，但在食品加工方面的研究和應(yīng)用目前尚無發(fā)現(xiàn)。前期采用MC3T3-E1成骨細(xì)胞對不同水產(chǎn)動物卵進(jìn)行活性篩選，研究結(jié)果表明，其唾液酸含量與增殖活性成正相關(guān)，其中鯽魚卵的作用效果最好。上述調(diào)查研究可知鯽魚卵具有潛在的利用價值和較大的開發(fā)空間。

本研究通過摘除雙側(cè)卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，從鯽魚卵中提取唾液酸糖蛋白研究其對骨質(zhì)疏松癥的改善作用并探討其作用機(jī)制，旨在為鯽魚卵的高值化利用和抗骨質(zhì)疏松癥的藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與動物

鮮活雌性鯽魚購于青島大連路水產(chǎn)品市場。

健康SD大鼠，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，SPF級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試劑

阿侖膦酸鈉片 石家莊石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；鈣測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；磷、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；雌二醇（estradiol，E2）、脫氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）、組織蛋白酶K（cathepsin-K，Cath-K）、骨源性堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（propeptide carboxy-terminal procollagen，PICP）、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒美國R&D公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；ALPHA 1-4 LO型凍干機(jī) 德國Christ公司；GL-20M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白的制備和化學(xué)成分分析

活體雌性鯽魚處死后取出新鮮成熟魚卵，在低溫條件下除雜、勻漿、冷凍干燥。干物加入95%乙醇脫脂，冷風(fēng)干燥得脫脂鯽魚卵。將脫脂鯽魚卵干物按1∶30（m/V）的料液比加水，于4℃攪拌水提過夜，離心，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得鯽魚卵唾液酸糖蛋白。采用二極管陣列串聯(lián)高效液相色譜法檢測鯽魚卵唾液酸糖蛋白中唾液酸含量為5.89%，苯酚-硫酸法檢測多糖含量為7.94%，福林-酚法檢測蛋白質(zhì)含量為44.25%，鉬藍(lán)比色法檢測磷含量為1.78%。

1.3.2 骨質(zhì)疏松癥模型的建立及動物分組

采用雙側(cè)卵巢摘除法建立骨質(zhì)疏松癥模型。將雌性SD未交配大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為去卵巢組和假手術(shù)組，腹腔注射3.3 mL/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠，去卵巢組摘除大鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組切除大鼠腹腔內(nèi)一小塊脂肪，術(shù)后連續(xù)3 d注射慶大霉素抗感染治療，術(shù)后90 d大鼠尾靜脈取血，檢測E2含量、TRACP和ALP活性，以去卵巢組與假手術(shù)組相比大鼠血清E2水平顯著降低（P＜0.01），TRACP和ALP活性顯著升高（P＜0.01）判定大鼠成模。

將成模大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對照組、陽性對照組、鯽魚卵唾液酸糖蛋白組，每組10只。鯽魚卵唾液酸糖蛋白組灌胃400 mg/（kg·d）鯽魚卵唾液酸糖蛋白，陽性對照組灌胃1 mg/（kg·d）的阿侖膦酸鈉，模型對照組和假手術(shù)組灌胃生理鹽水。灌胃體積1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)灌胃90 d。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，每3 d稱量一次大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d將大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，離心取上清，備用。于末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)乙醚麻醉后腹主動脈采血，分離血清，備用。

1.3.3 尿液脫氧吡啶啉、鈣、磷含量的測定

具體操作方法參照相應(yīng)試劑盒說明書。

1.3.4 血清Cath-K、TRACP活性的測定

具體操作方法參照相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書。

1.3.5 血清骨源性ALP活性和OCN、PICP含量的測定

具體操作方法參照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書。

1.3.6 血清OPG、RANK、RANKL含量的測定

具體操作方法參照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異顯著，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠尿液DPD、Ca、P含量的影響

表1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

表1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

注：# #.與假手術(shù)組相比，差異極顯著（P＜0.01）；*.與模型對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與模型對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別 DPD含量/（nmol/L） Ca含量/（mmol/L） P含量/（mmol/L） TRACP活力/（U/L） Cath-K含量/（pg/mL）假手術(shù)組 43.43±8.55 0.4 3±0.03 31.17±5.82 19.98±2.58 1 273.54±104.85模型對照組 82.20±8.09## 1.29±0.24## 53.51±2.74## 42.18±1.67## 2 450.90±153.01##陽性對照組 64.02±6.15** 0.93±0.23** 41.29±2.06** 30.80±1.26** 1 558.6±114.02**唾液酸糖蛋白組 60.69±5.92** 0.69±0.09** 33.32±1.62** 22.97±2.84** 1 489.32±118.80**

由表1可知，DPD是Ⅰ型膠原的分解產(chǎn)物，是反映骨吸收的特異性指標(biāo)。模型對照組大鼠尿液DPD含量較假手術(shù)組顯著升高；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，DPD含量顯著降低，與模型對照組相比降低了26.16%（P＜0.01）。去卵巢大鼠骨吸收增加，溶骨活性增強(qiáng)，骨中Ca、P釋放進(jìn)入血液循環(huán)，經(jīng)腎臟后以尿液形式排出，因此尿液中Ca、P含量一定程度上反映骨鹽丟失情況。模型對照組大鼠尿液Ca、P含量較假手術(shù)組顯著升高；與模型對照組相比，灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后Ca、P含量顯著降低，分別降低了46.87%（P＜0.01）和37.73%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白的作用效果較陽性對照組藥物作用效果更顯著。結(jié)果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可有效抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收，防止骨礦鹽丟失。

2.2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠血清TRACP、Cath-K活性的影響

由表1可知，TRACP由破骨細(xì)胞合成并分泌，它參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化底物的降解；Cath-K是由破骨細(xì)胞分泌的一種能水解Ⅰ型膠原的蛋白酶，二者都是敏感的特異性骨吸收標(biāo)志物。模型對照組大鼠血清TRACP、Cath-K活性較假手術(shù)組顯著升高。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后二者活性均顯著降低，與模型對照組相比，分別降低了45.55%（P＜0.01）和39.23%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白作用效果優(yōu)于陽性對照組的藥物作用效果。結(jié)果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收。

2.3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量的影響

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨生成指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠骨生成指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

組別 BALP活力/（U/L） OCN含量/（ng/mL） PICP含量/（ng/mL）假手術(shù)組 85.08±3.45 3.46±0.45 6.25±0.36模型對照組 190.01±6.65## 6.25±0.46## 8.61±0.53##陽性對照組 113.53±4.24** 3.85±0.32** 6.40±0.37**唾液酸糖蛋白組 103.97±4.93** 3.70±0.58** 6.45±0.25**

由表2可知，BALP是成骨細(xì)胞分泌的胞外酶，參與骨的礦化過程，可反映成骨細(xì)胞活性。與假手術(shù)組相比，模型對照組大鼠血清BALP活性升高了123.35%（P＜0.01）；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，BALP活性顯著降低，與模型對照組相比降低了45.28%（P＜0.01）。OCN是由成骨細(xì)胞合成并分泌的骨組織中最豐富的非膠原蛋白。模型對照組與假手術(shù)組大鼠相比血清OCN含量升高了80.94% （P＜0.01）；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后OCN含量降低了40.85%（P＜0.01）。

PICP與骨基質(zhì)的重要組成成分Ⅰ型膠原的合成成正相關(guān)。與假手術(shù)組相比，模型對照組PICP含量顯著升高；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，PICP含量顯著降低，與模型對照組相比降低了25.17%（P＜0.01）。結(jié)果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白能有效抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠高骨轉(zhuǎn)換速率，防止骨丟失。

2.4 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠血清OPG、RANK、RANKL含量的影響

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影響（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質(zhì)疏松癥大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影響（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

組別 OPG含量/（pg/mL） RANK含量/（pg/mL） RANKL含量/（pg/mL） RANKL/OPG假手術(shù)組 12.47±1.45 34.44±3.09 15.75±1.01 1.27±0.14模型對照組 7.01±1.08## 36.27±5.82# 29.42±3.07## 4.29±0.86##陽性對照組 9.23±1.18** 30.77±4.16* 21.72±1.81** 2.37±0.28**唾液酸糖蛋白組 10.97±0.62** 28.70±2.65* 19.80±1.86** 1.77±0.11**

由表3可知，OPG和RANKL由成骨細(xì)胞分泌，RANK由破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分泌，OPG通過競爭性地與RANKL結(jié)合，可阻斷RANKL與RANK的相互作用，抑制破骨細(xì)胞增殖分化，因此RANKL和OPG的比值決定了骨吸收的程度。模型對照組血清OPG含量顯著低于假手術(shù)組，RANK、RANKL含量顯著高于假手術(shù)組，且模型對照組RANKL/OPG比值與假手術(shù)組相比升高了236.37%（P＜0.01）。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，與模型對照組相比，OPG含量降低了56.50%（P＜0.01），RANK含量降低了20.87%（P＜0.05），RANKL含量降低了32.69%（P＜0.01），RANKL/OPG比值降低了58.74%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白作用效果優(yōu)于陽性對照藥物的作用效果。結(jié)果證明鯽魚卵唾液酸糖蛋白能通過下調(diào)RANKL/OPG比值來抑制破骨細(xì)胞形成，從而抑制骨吸收。

3 討 論

切除卵巢是復(fù)制骨質(zhì)疏松癥模型的經(jīng)典方法，與臨床上絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥極為相似。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動物模型是由Saville[10]于1969年首先用大鼠建立的，由于大鼠去卵巢后的骨丟失與婦女絕經(jīng)后的骨丟失有許多相似之處，故去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型已成為標(biāo)準(zhǔn)化的、公認(rèn)的研究絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典病理模型[11]，目前已在國內(nèi)外廣泛的應(yīng)用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過切除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松癥模型，以鯽魚卵唾液酸糖蛋白為受試物研究其對骨質(zhì)疏松癥的改善作用，測定骨吸收、骨生成指標(biāo)和OPG、RANK、RANKL含量，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收和骨生成指標(biāo)，改善大鼠高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，顯著下調(diào)血清RANKL含量，上調(diào)OPG含量，降低RANKL/OPG比值。

骨代謝主要以骨重建形式進(jìn)行，在調(diào)節(jié)激素和局部細(xì)胞因子等協(xié)同作用下，不斷吸收舊骨，生長新骨，周而復(fù)始，循環(huán)進(jìn)行，形成了體內(nèi)骨骼相對穩(wěn)定狀態(tài)。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收相對增強(qiáng)，或者成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成相對減弱，使骨凈吸收增加，骨微結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[14]。在骨吸收發(fā)生時，骨的Ⅰ型膠原會分解生成DPD，釋放到血液中并以原形直接經(jīng)腎臟以尿液形式排出[15]。Ca、P主要作用是促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和骨礦沉積，當(dāng)骨丟失嚴(yán)重時，尿液中Ca、P含量升高。TRACP由破骨細(xì)胞合成并直接分泌進(jìn)入血液循環(huán)，半衰期長，穩(wěn)定性好，可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀況[16]。Cath-K是破骨細(xì)胞分泌的一種半胱氨酸蛋白酶，能水解Ⅰ型膠原等骨基質(zhì)蛋白，是重要的破骨細(xì)胞分子標(biāo)記物和骨吸收標(biāo)志性指標(biāo)[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低去卵巢大鼠尿液DPD、Ca、P含量，顯著抑制血清Cath-K、TRACP活性。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收，防止骨礦鹽丟失的作用。

當(dāng)骨中鈣鹽沉積不足時，成骨細(xì)胞對BALP的分泌增多，BALP是評價骨礦化障礙的最佳指標(biāo)[18]。OCN可用于直接反映骨生成的速率[19]，它是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，骨更新速率越快，成骨細(xì)胞分泌OCN越多。Ⅰ型膠原是骨基質(zhì)的重要組成成分，PICP與Ⅰ型膠原的合成呈正相關(guān)[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低去卵巢大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠高骨轉(zhuǎn)換速率，防止骨丟失的作用。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是成骨細(xì)胞作用于破骨細(xì)胞的重要途徑，是目前骨質(zhì)疏松癥防治的一個重大突破[21]。OPG和RANKL主要由成骨細(xì)胞分泌，其中，RANKL通過與破骨細(xì)胞表面靶信號受體RANK作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖、分化、成熟和活化，引起骨吸收。而OPG可競爭性地與RANKL結(jié)合，從而阻斷骨吸收信號的傳遞。因此，RANKL/OPG的比例是骨吸收的關(guān)鍵因素之一[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著上調(diào)去卵巢大鼠血清OPG含量，下調(diào)RANKL含量，降低RANKL/OPG比值。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨細(xì)胞增殖分化，防止骨吸收的功能。

綜上所述，鯽魚卵唾液酸糖蛋白能顯著調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝，抑制高骨轉(zhuǎn)換速率，防止骨丟失。其抗骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制可能與RANKL/OPG比值下調(diào)相關(guān)，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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