周 毅

尚志市人民醫(yī)院，黑龍江 尚志 150601

結(jié)核分枝桿菌檢驗方法分析

周 毅

尚志市人民醫(yī)院，黑龍江 尚志 150601

目的探討結(jié)核分枝桿菌的臨床檢驗方法。方法選取2012年5月～2013年9月我院收治的由結(jié)核分枝桿菌引起疾病的患者24例，對臨床病灶位置采集標(biāo)本進(jìn)行檢驗。結(jié)果通過檢驗培養(yǎng)分析結(jié)核分枝桿菌對紫外線的耐受程度，90%結(jié)核分枝桿菌在3～5小時內(nèi)紫外線照射下均能被殺死。討論通過臨床檢驗分析，結(jié)核分枝桿菌營養(yǎng)要求高、生長緩慢，結(jié)核分枝桿菌對紫外線的抵抗力弱。

結(jié)核分枝桿菌；檢驗；方法

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis）、牛分枝桿菌（M．bovis）、非洲分枝桿菌（M．a(chǎn)fricanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti）。前三種對人類有致病性。選擇2012年5月～2013年9月我院收治的由結(jié)核分枝桿菌引起疾病的患者24例，對臨床檢驗資料進(jìn)行總結(jié)如下。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年5月～2013年9月，我院收治的由結(jié)核分枝桿菌引起疾病的患者24例，其中男性患者14例，女性患者10例。對病灶部位進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)采集做病理檢驗，確診疾病病原菌為結(jié)核分枝桿菌。

1.2 方法

結(jié)核病的標(biāo)本采集視病變部位而定。一般肺結(jié)核可以采集痰、支氣管洗滌或喉拭子；結(jié)核性胸膜炎采集胸腔積液、腹水等；腸結(jié)核可采集糞便；腎結(jié)核者采集尿液；皮膚結(jié)核采集膿液或傷口分泌物。各種結(jié)核都可以采集病灶組織標(biāo)本。具體的標(biāo)本采集方法及涂片方式：（1）痰標(biāo)本的采集：留取清晨咳痰3～5 ml。如咳痰少可以收集前一天晚至清晨咳出的全部痰；也可以通過3%～l0%的鹽水霧化吸入或口服氯化銨促進(jìn)排痰[1]。（2）直接涂片：因直接挑取標(biāo)本（或處理標(biāo)本）涂抹載玻片而得名。根據(jù)涂抹的厚度可以分為薄片和厚片。取0.0l ml標(biāo)本涂抹10 mm×10 mm范圍為薄片，取0.1 ml涂抹20 mm×15 mm為厚片。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，對臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計對比處理，計量結(jié)果采用t檢驗，P＜0.05，則差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

通過檢驗培養(yǎng)分析結(jié)核分枝桿菌對紫外線的耐受程度，發(fā)現(xiàn)90%結(jié)核分枝桿菌在3～5小時內(nèi)紫外線照射下均能被殺死。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長略帶彎曲的桿菌，有分枝生長趨勢，單個、成堆或呈束狀排列，大?。?.3～0.6）μm×（1～4）μm，形態(tài)如球狀、串珠狀或絲狀，革蘭染色不易著色，其抗酸染色陽性，一般采用齊-尼（Ziehl-Neelsen，E-N）抗酸染色后，結(jié)核分枝桿菌呈紅色，非抗酸菌染色呈藍(lán)色。結(jié)核分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中細(xì)菌生長較快，一般1～2周即可生長，分枝桿菌先于管底生長，可出現(xiàn)沉淀，然后隨管壁上升到表面生長形成菌膜，有毒的菌株在液體培養(yǎng)基中呈束狀生長。利用分枝桿菌能耐酸堿的特性，用酸堿處理標(biāo)本使標(biāo)本中的雜菌被抑制甚至殺死，同時還可以溶解標(biāo)本中的黏液、膿汁、蛋白等，使其中包裹的分枝桿菌釋放出來，提高檢出率?？梢圆捎孟率龇椒▉硖幚恚海?）酸處理法：取痰標(biāo)本數(shù)毫升，加入2～4倍的4%硫酸（依據(jù)標(biāo)本的黏稠度來定），振蕩混勻，室溫放置20分鐘，其間振搖2～3次促進(jìn)液化。該法適用于接種堿性L-T培養(yǎng)基。（2）堿處理法：取痰標(biāo)本數(shù)毫升，加入2～4倍量2%氫氧化鈉（依據(jù)標(biāo)本的黏稠度來定），振蕩器上振蕩5～10分鐘（或置室溫30分鐘），其間振搖2～3次。該法適用于接種酸性L-J培養(yǎng)基。（3）苯扎溴銨法：將痰標(biāo)本加入1～2倍量的0.1%胰蛋白酶溶液，振蕩至消化均勻，加入l／2量的0.3%新潔爾滅，混勻后室溫放置5分鐘[2]。

結(jié)核分枝桿菌的染色常采用抗酸染色和金胺〇染色。（1）齊-尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色：將標(biāo)本原涂片經(jīng)干燥、火焰固定后加初染液，加熱至出現(xiàn)蒸氣3～5分鐘，不能沸騰，不能蒸干，冷卻水洗。加脫色液直至紅色剛好消退（不得超過l0分鐘），水洗。加復(fù)染液復(fù)染0.5～1.0分鐘（集菌染片可1～3分鐘），水洗，自然干燥后鏡檢[3]。結(jié)果抗酸菌呈紅色或粉紅色，背景和其他雜菌呈藍(lán)色。取堿性復(fù)紅貯存液（取型號為89的堿性復(fù)紅液溶于95%乙醇100 m1中）10 ml加5%碳酸水溶液90 ml，混勻即是初染液。濃鹽酸3 ml加95%乙醇97 ml，混勻即為脫色液。而復(fù)染色液則是取亞甲藍(lán)0.3 g溶于95%乙醇50 ml，然后加水至100 ml，混勻。用時10倍稀釋即可。（2）金胺〇染色：標(biāo)本經(jīng)涂片干燥、火焰固定后，滴加初染液，10～15分鐘后水洗。加脫色液l～2分鐘直至無黃色，水洗。加復(fù)染液l～2分鐘，水洗，自然干燥后熒光顯微鏡檢。結(jié)果為背景黑色，抗酸菌顯金黃色或橙黃色熒光。

細(xì)菌鑒別顯示，凡7天內(nèi)生長菌落者為快速生長分枝桿菌（RunyonⅣ群），7天以上生長者為慢生長分枝桿菌，而結(jié)核分枝桿菌為慢生長分枝桿菌。分離菌株接種3支L-J培養(yǎng)基，2支用鋁箔或黑紙包裹密封，另1支不包紙，置于37℃5%～l0%二氧化碳條件下培養(yǎng)。當(dāng)未包紙的試管內(nèi)有肉眼可見的菌落生長時，打開l支包紙管觀察其菌落有無色素產(chǎn)生。如果有色素產(chǎn)生則為暗產(chǎn)色菌（Runyon，Ⅱ群）；若無色素產(chǎn)生，則開啟試管膠塞通氣，增加管內(nèi)氧含量，并做光照試驗：以100 W燈泡在相距50 cm處照射3小時，繼續(xù)置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，每天觀察l次，并與另1支未打開的紙包管比較產(chǎn)生的色素。產(chǎn)生色素者為光產(chǎn)色菌（Runyon l群）。

結(jié)核分枝桿菌在5%～l0%的C02條件下對其生長有促進(jìn)作用，其對營養(yǎng)要求高，并且對某些營養(yǎng)成分有特殊的要求。例如，結(jié)核分枝桿菌專嗜甘油為碳源，分枝桿菌則以丙硐酸鹽為碳源。天冬酰胺是結(jié)核分枝桿菌生長最好的氮源，鉀、鎂、鐵、磷等無機(jī)離子均對其生長有促進(jìn)作用。

［1］ 毛太蘭． 小金縣疾控中心結(jié)核分枝桿菌檢測方法探討[J]． 中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2014, 35（5）: 3．

［2］ 周珍文． 分枝桿菌的實驗室診斷[J]． 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，37（3）: 239-240．

［3］ 杜彥懿，王平，張文莉，等． 涂片鏡檢法與培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果比較． 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011，31(24): 83-84．

The Analysis on Testing Methods of Mycobacterium Tuberculosis

ZHOU Yi , Shangzhi People's hospital, Shangzhi Heilongjiang 150601, China

ObjectiveThe clinical testing methods of mycobacterium tuberculosis is to be investigated.MethodsTested the clinical collecting specimens of lesion location from 24 cases of patients with mycobacterium tuberculosis who were treated in hospital from May 2012 to September 2013.ResultsBy examining and testing the tolerance degree of mycobacterium tuberculosis to UV, 90 percent of mycobacterium tuberculosis could be killed with explosion to UV in 3～ 5 hours.ConclusionClinical testing shows that mycobacterium tuberculosis requires high nutrition, and it grows with slow speed, the resistance power of mycobacterium tuberculosis to UV is rather weak.

Mycobacterium tuberculosis, Testing, Methods

R450

】B

1674-9316（2014）10-0048-02

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2014.10.024