楊艷麗 劉 玲 王 豫 劉曉丹 周平坤

自噬是指細(xì)胞將一些聚集或錯誤折疊蛋白、損傷的細(xì)胞器等胞質(zhì)成分通過包裹并最終運送至溶酶體降解的過程，可促進(jìn)細(xì)胞代謝的原料的循環(huán)再利用［1］。目前認(rèn)為，自噬的主要功能之一是真核細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、生長因子撤除、能量匱乏或受到應(yīng)激性的死亡威脅時，使細(xì)胞獲得對抗不利的生長環(huán)境、維持穩(wěn)態(tài)、實現(xiàn)更新的一種重要的自我保護(hù)性反應(yīng)機(jī)制［2］。但是，當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的不可修復(fù)的損傷，如大劑量的電離輻射輻照、某些化療藥物的作用，自噬就會轉(zhuǎn)變成為細(xì)胞的一種死亡機(jī)制。正是由于自噬在決定細(xì)胞命運中具有雙面性，有關(guān)其調(diào)控機(jī)制的研究受到極大關(guān)注。

生長因子刺激信號通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR信號途徑抑制自噬，而Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物(PI3KC3/Vps34)是啟動細(xì)胞自噬的一個關(guān)鍵調(diào)控復(fù)合體，PI3KC3/Vps34被激活后會產(chǎn)生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP)，PIP則促進(jìn)其他自噬相關(guān)蛋白家族成員(autophagy related protein family，Atg)的募集，啟動自噬過程［3，4］。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)是一種磷脂酰肌醇3激酶抑制劑，因其能抑制參與自噬調(diào)節(jié)的Ⅲ型PI3K的活性，而被廣泛用于自噬研究［6］。筆者前期的實驗也證實，3-MA可以抑制饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并增加細(xì)胞的放射敏感度。本研究發(fā)現(xiàn)，3-MA單獨作用也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，進(jìn)一步對3-MA在輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬及凋亡中的作用進(jìn)行探討，將為今后3-MA合理使用以及放射誘發(fā)自噬機(jī)制的闡述提供新的依據(jù)。

材料與方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)和試劑:人子宮頸癌細(xì)胞HeLa為本實驗室留存。細(xì)胞在含10%胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM(Hyclone公司)中，37℃ 5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3-甲基腺嘌呤(3-MA)購自Sigma公司。

2．細(xì)胞照射:利用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所的60Co放射源γ射線照射，照射劑量率為128．81 cGy/min。

3．CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試驗分析細(xì)胞存活:將預(yù)定數(shù)量細(xì)胞接種于A、B兩個96孔板中，A板4Gy γ射線照射，B板不照射。照射組和不照射組分別又分為加3-MA組和不加3-MA組，細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于不同時間吸干培養(yǎng)液(每個時間設(shè)3～5個復(fù)孔)，加入含10μl CCK-8(DojinDO公司)的新鮮培養(yǎng)液 100μl，孵育 1h后，450nm波長測量吸光值(OD值)，根據(jù)OD值計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實驗組OD值 -空白孔OD值)/(對照組OD值 -空白OD值)×100%。其中實驗組為照射和(或)3-MA處理細(xì)胞組，對照組為未經(jīng)任何處理的細(xì)胞組，空白組為單純培養(yǎng)基加上CCK-8試劑。

4．AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記檢測細(xì)胞凋亡:將細(xì)胞分為照射和不照射兩組，每組又分為照射前3h加3-MA和不加3-MA 兩個亞組，分別 4Gy 照射后 0、6、24、30、48、72h 后，用0．25%胰酶消化，并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次;以1×106/ml的密度重懸細(xì)胞于500μl緩沖液(含Ca2+)中;分別加入5μl annexinⅤ -FITC 和 5μl碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，輕輕混勻，室溫避光孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。進(jìn)行3次重復(fù)實驗取平均值。

6．Western blot法檢測蛋白表達(dá):用PBS洗滌各組細(xì)胞2次后，使用M-PER蛋白裂解液冰上裂解蛋白30min，12000×g離心15min，收集上清液。采用二喹啉甲酸法(BCA法)測定蛋白濃度后，將蛋白與6×上樣緩沖液混勻，100℃煮沸5min，蛋白上樣量為20μg，行8%SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶于室溫下封閉1h;分別加入一抗SQSTM1/p62、GAPDH(Santa Cruz公司)，4℃培育過夜后，TBST清洗3次;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋公司)室溫?fù)u晃孵育1h后，TBST清洗3次，顯影。

7．GFP-LC3轉(zhuǎn)染及免疫熒光分析:采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染帶熒光標(biāo)記GFP的自噬標(biāo)記蛋白輕鏈3(GFP-LC3)的質(zhì)粒于HeLa細(xì)胞;轉(zhuǎn)染后24h 4Gyγ射線照射，不同時間點收集細(xì)胞，4%多聚甲醛固定并置于4℃冰箱。將固定好的細(xì)胞 PBS洗3次，每次5min。用終濃度0．3%TritonX-100 透膜處理15min，PBS洗3 次每次5min，最后用DAPI染色細(xì)胞核20min，再用PBS洗3次每次5min，封片。熒光顯微鏡觀察自噬體的形成，計數(shù)自噬體數(shù)量，實驗重復(fù)3次。

8．統(tǒng)計學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 13．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行，多樣本間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．3-MA的細(xì)胞增殖毒性及對γ放射損傷的影響:由于5mmol/L是文獻(xiàn)報道中3-MA較常用的的工作濃度，為此筆者設(shè)定3-MA作用濃度為5mmol/L，將HeLa細(xì)胞分為4組即:60Co γ射線4Gy照射組、3-MA處理組、照射加3-MA組和實驗對照組(Control)。分別于照后 3(細(xì)胞貼壁后)、6、9、12、48和72h，用CCK-8試劑檢測了不同處理后HeLa細(xì)胞的增殖和毒性效應(yīng)(表1)，結(jié)果顯示各處理組與對照組相比，在12h以內(nèi)細(xì)胞增殖沒有明顯的影響;3-MA作用24h可發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖毒性，單獨4Gy照射組與不做任何處理的對照組相比尚無明顯變化;在照射后或3-MA作用48h以上時間，各實驗組的OD值不但不增加，反而低于24h時間節(jié)點值，顯示出明顯的致死性細(xì)胞毒效應(yīng)，而且5mmol/L 3-MA處理比4Gy照射的致細(xì)胞死亡毒性更大;72h則顯示復(fù)合毒性效應(yīng)，細(xì)胞存活率更是下降到正常細(xì)胞的40%左右。

表1 4Gy照射和3-MA單獨和復(fù)合作用的細(xì)胞毒性的時間效應(yīng)(OD值，±s)

表1 4Gy照射和3-MA單獨和復(fù)合作用的細(xì)胞毒性的時間效應(yīng)(OD值，±s)

a與相應(yīng)時間對照組相比，aP＜0．05;與相應(yīng)時間的4Gy照射組相比，bP＜0．05;相應(yīng)時間的各組方差分析，cP=0．00

時間(h)處理方式0 3-MA 4Gy 4Gy+3-MA P 93 6 1．27 ±0．02 1．27 ±0．06 1．22 ±0．06 1．22 ±0．02 0．10 9 1．29 ±0．03 1．29 ±0．12 1．24 ±0．06 1．29 ±0．08 0．26 12 1．49 ±0．03 1．48 ±0．08 1．44 ±0．07 1．48 ±0．04 0．61 24 1．86 ±0．04 1．63 ±0．02a，b 1．80 ±0．04 1．73 ±0．02a，b 0．00c 48 1．96 ±0．09 1．14 ±0．11a，b 1．73 ±0．09a 1．13 ±0．05a，b 0．00c 72 1．88 ±0．09 1．00 ±0．10a，b 1．36 ±0．05a 0．91 ±0．02a，b 0．00 3 1．21 ±0．03 1．23 ±0．05 1．21 ±0．03 1．22 ±0．06 0．c

2．3-MA促進(jìn)受照射細(xì)胞凋亡:細(xì)胞經(jīng)4Gy照射或5mmol/L 3-MA單獨或聯(lián)合作用后不同時間，AnnexinⅤ-FITC/PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡(圖1)。與未經(jīng)過任何處理的對照組相比，加3-MA作用或4Gy照射細(xì)胞24h以后，凋亡率顯著高于對照組。而且，5mmol/L 3-MA的細(xì)胞凋亡效應(yīng)比4Gy照射更大，并隨作用時間延長而增加，作用48h，顯示出3-MA與照射的復(fù)合效應(yīng)，說明3-MA大于48h的長時間處理能顯著促進(jìn)受照射細(xì)胞的凋亡發(fā)生。

圖1 AnnexinⅤ-FITC/PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測3-MA對4Gy γ射線誘發(fā)細(xì)胞凋亡的影響

3．3-MA自身及對γ射線誘導(dǎo)自噬的影響:在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來觀察自噬體形成，并計數(shù)每個細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自噬體數(shù)目。結(jié)果顯示:5mmol/L 3-MA單獨作用的HeLa細(xì)胞，可觀察到自噬體的形成，并隨著時間的延長顯著增多(圖2A)，作用后12h，可以明顯觀察由3-MA單獨誘導(dǎo)的自噬體數(shù)目比單獨4Gy照射更多(圖2B);4Gy照射HeLa細(xì)胞，在照后6～9h自噬體的形成達(dá)到最高峰;意外的是，當(dāng)γ射線照射前3h加入3-MA作用時，自噬在各個時間點均處于抑制狀態(tài)。自噬選擇性底物SQSTM1/p62蛋白的降解是細(xì)胞自噬的標(biāo)志之一，各組細(xì)胞在4Gy或5mmol/L 3-MA單獨或聯(lián)合作用后不同時間點收集細(xì)胞，通過Western blot檢測SQSTM1/p62的蛋白量變化。3-MA和4Gy照射單獨處理的HeLa細(xì)胞，SQSTM1/p62蛋白量在3h內(nèi)是表達(dá)增加的。隨時間延長逐漸減少(圖3)。而細(xì)胞在照射前3h加3-MA處理后，SQSTM1/p62表達(dá)基本處于同一水平，說明3-MA與輻射聯(lián)合作用，抑制了SQSTM1/p62蛋白的降解，顯示輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬受到抑制，此結(jié)果與圖3一致。

討 論

自噬被認(rèn)為是除DNA修復(fù)和細(xì)胞周期檢查點反應(yīng)以外的細(xì)胞免受電離輻射DNA損傷致死效應(yīng)的保護(hù)性機(jī)制之一［8，9］。也有研究報道，自吞噬如同凋亡一樣，是電離輻射所致細(xì)胞死亡的通路之一［10］。由此可見，電離輻射作用細(xì)胞的自噬機(jī)制和生物學(xué)后果比較復(fù)雜。而在自噬的研究中，3甲基腺嘌呤因被視為自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶的抑制劑，而用于包括輻射在內(nèi)的多種理化因子和環(huán)境因素誘發(fā)自噬的研究，在運用中普遍采用5mmol/L的較高作用濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，3-MA在較高濃度下(如5mmol/L)長時間作用超過24h能顯著影響細(xì)胞存活率，并比4Gy照射更能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，3-MA與輻射同時作用超過一定的時間，則顯示出更強(qiáng)的復(fù)合毒性。因此3-MA抑制自噬作用的時間和劑量特異性還有待進(jìn)一步明確。本研究顯示輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，但3-MA單獨作用于細(xì)胞也可以促進(jìn)自噬，這很可能與3-MA持續(xù)抑制Ⅰ型PI3K從而促進(jìn)自噬有關(guān)［11］。實驗還發(fā)現(xiàn)，3-MA與4Gy照射聯(lián)合作用的24h內(nèi)，HeLa細(xì)胞自噬和自噬底物SQSTM1/p62蛋白的降解得到了有效的抑制，其機(jī)制還有待進(jìn)一步明確，可能是3-MA誘發(fā)自噬后，使細(xì)胞對后來的4Gy照射產(chǎn)生了適應(yīng)性反應(yīng)，也可能是輻射后，3-MA作為PI3K抑制劑發(fā)揮功能，通過抑制Ⅲ類PI3K抑制了細(xì)胞自噬。

圖2 免疫共聚焦檢測5mmol/L 3-MA處理后，照射及未照射細(xì)胞自噬體的形成

圖3 Western blot檢測5mmol/L 3-MA處理后，照射及未照射細(xì)胞自吞噬蛋白SQSTM1/p62表達(dá)變化

對照之前的細(xì)胞存活及凋亡結(jié)果，筆者得出結(jié)論，3-MA能有效抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，也能有效促進(jìn)正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬。長時間作用能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，尤其促進(jìn)輻射后的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞毒性效應(yīng)濃度下的3-MA誘發(fā)自噬和凋亡作用的揭示，為今后工作中3-MA作為自噬抑制劑的合理使用和結(jié)果的解釋提供了有價值的信息。

1 Mizushima N．Autophagy:process and function［J］．Genes Development，2007，21(22):2861-2873

2 Shintani T，Klionsky DJ．Autophagy in health and disease:a doubleedged sword［J］．Science，2004，306(5698):990-995

3 Funderburk SF，Wang QJ，Yue Z．The Beclin 1-VPS34 complex--at the crossroads of autophagy and beyond［J］．Trends Cell Biol，2010，20(6):355-362

4 Mah LY，Ryan KM．Autophagy and cancer［J］．Cold Spring Harbor perspectives Biol，2012，4(1):a008821

6 Kong D，Yamori T．Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors:promising drug candidates for cancer therapy［J］．Cancer Sci，2008，99(9):1734-1740

7 李俊英，楊艷麗，張赫，等．自吞噬促進(jìn)電離輻射之后細(xì)胞的存活［J］．輻射防護(hù)，2013，33(4):193-198，248

8 Qiang L，Wu C，Ming M，et al:Autophagy controls p38 activation to promote cell survival under genotoxic stress［J］．J Biol Chem，2013，288(3):1603-1611

9 Liang B，Kong D，Liu Y，et al:Autophagy inhibition plays the synergetic killing roles with radiation in the multi-drug resistant SKVCR ovarian cancer cells［J］．Rad Oncol，2012，7:213

10 Anbalagan S，Pires IM，Blick C，et al．Radiosensitization of renal cell carcinoma in vitro through the induction of autophagy［J］．Radiotherapy Oncol，2012，103(3):388-393

11 Wu YT，Tan HL，Shui G，et al:Dual role of 3-methyladenine in modulation of autophagy via different temporal patterns of inhibition on class I and III phosphoinositide 3-kinase［J］．J Biolo Chem，2010，285(14):10850-10861