劉洋,張清平,段文鋒

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院 國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(上海)，上海200233)

0 引 言

雙歧桿菌是能在人和動(dòng)物腸道內(nèi)定植的益生菌，最早由法國(guó)巴斯德研究所Tissier博士于1899年首次從母乳喂養(yǎng)兒的糞便中分離發(fā)現(xiàn)，1924年命名為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)[1]。大量研究表明，雙歧桿菌能抑制致病菌入侵和定植、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、降低膽固醇、抑制腫瘤發(fā)生等，在維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡和宿主健康方面發(fā)揮著重要的作用。因此，雙歧桿菌成為近年來(lái)食品、藥品研究開發(fā)的熱點(diǎn)，部分菌株大量用于嬰幼兒配方食品、保健食品、藥品的生產(chǎn)中。但雙歧桿菌發(fā)揮有益功能具有很強(qiáng)的菌株特異性，為此FAO/WHO益生菌評(píng)價(jià)指南中指出，精確的菌株識(shí)別是益生菌使用的前提[2]，因此，雙歧桿菌的分類鑒定一直是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)，分子生物學(xué)方法成為雙歧桿菌分類鑒定的主要手段，本文就目前常用的分子分型鑒定技術(shù)特點(diǎn)和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 雙歧桿菌屬的分類學(xué)進(jìn)展

微生物分類是不斷發(fā)展變化的動(dòng)態(tài)過程，雙歧桿菌也不例外[3-5]。早期的屬水平的鑒別方法都局限于形態(tài)學(xué)和生理生化方法，而雙歧桿菌屬的特征又很多樣化。從發(fā)現(xiàn)到20世紀(jì)中期，雙歧桿菌先后被劃入芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、放線菌屬[4]。近30多年，分子生物學(xué)技術(shù)高速發(fā)展，從Scardovi最早利用DNADNA雜交的方法研究雙歧桿菌的分類開始，雙歧桿菌屬的命名從表型進(jìn)入了遺傳型階段[6]。2004年，Liesbeth等根據(jù)DNA-DNA雜交、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性、atpD及groEL基因序列分析等將乳雙歧桿菌(B.lactis)重新劃分為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(B.animalis subsp.lactis)[7]；2008年，Mattarelli等根據(jù)DNA-DNA雜交、16S rDNA及hsp60基因序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性、BOXPCR、變性梯度凝膠電泳等數(shù)據(jù)，將長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)重新劃分為3個(gè)亞種：長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(B.longum subsp.longum)、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種 (B.longum subsp.in fantis)、長(zhǎng)雙歧桿菌豬亞種(B.longum subsp.suis)[8]。 2011年，Hidetoshi等發(fā)表了雙歧桿菌屬的一個(gè)新種B.kashiwanohense[9]。 2012年，Akihito Endo等發(fā)布了5個(gè)新種，B.reuteri,B.callitrichos,B.saguini,B.stellenboschense和B.biavatii[10]。截止目前，該屬包含41個(gè)種，9個(gè)亞種，模式種為兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)。

2 雙歧桿菌屬的分子分型鑒定方法

目前，根據(jù)分子分型技術(shù)的原理不同主要可分為2大類，分別為基于測(cè)序的分型鑒定方法，基于DNA印跡的分型鑒定方法。其中基于測(cè)序的方法主要如16S rDNA和16S-23S rDNA間區(qū)序列分析、多位點(diǎn)測(cè)序分型方法(Multilocus sequence typing,MLST)。基于DNA印跡的方法又分為2小類，一類為無(wú)需PCR而直接根據(jù)基因組序列特征分型，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 分 析 (Restriction fragment length polymorphisms,RFLP)；一類為基于PCR技術(shù)的印跡法，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù) (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、rep-PCR方法(Repetitive ExtragenicPalindromic PCR,REP-PCR)。

2.1 基于測(cè)序的分型鑒定方法

2.1.1 16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列分析

16S rDNA序列分析是目前細(xì)菌分類鑒定中最常用和必須進(jìn)行的一種鑒定分析方法，能確定細(xì)菌的新的分類命名地位。主要步驟包括：基因組DNA提取、16S rDNA的擴(kuò)增、16S rDNA基因測(cè)序和序列分析。將目標(biāo)序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列比對(duì)，分析相似度和進(jìn)化關(guān)系，確定分類地位。一般認(rèn)為，16S rDNA序列93%～99%的相似度可認(rèn)為是具有緊密親緣關(guān)系，有別于其他菌屬[11]。Stackebrandt等提出同種的16S rDNA基因序列同源性應(yīng)大于97%，作為種水平的判別標(biāo)準(zhǔn)[6]。雙歧桿菌屬的16S rDNA序列相似度介于87.7%～99.5%之間，部分長(zhǎng)雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧相似度達(dá)到99%以上，不具備種內(nèi)區(qū)分雙歧桿菌的能力[12]。王濤等利用16S rDNA對(duì)人體糞便中分離的1株雙歧桿菌進(jìn)行鑒定[13]。高鵬飛等利用16S rDNA對(duì)從12位健康蒙古族兒童糞便中分離得到11株雙歧桿菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)B.animalis V9與乳雙歧桿菌BB12的同源性為99%，有望在乳制品和保健產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用[14]。近年來(lái)，二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得益生菌菌群分析進(jìn)行高通量時(shí)代。Gulitz等研究者利用基于焦磷酸測(cè)序的16S rDNA分析對(duì)水開菲爾(water kefir)發(fā)酵飲料進(jìn)行菌群分析，發(fā)現(xiàn)大量的嗜冷雙歧桿菌(B.psychraerophilum)，針對(duì)16S rDNA的高通量測(cè)序技術(shù)將成為對(duì)發(fā)酵食品菌群進(jìn)行深度分析的有力工具[15]。

16S rDNA和23S rDNA基因之間的區(qū)域，稱為內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally transcribed spacer，ITS)，較16S rDNA和23S rDNA進(jìn)化快，不同菌的序列長(zhǎng)度和堿基差異較大，用于區(qū)分和鑒定親緣關(guān)系相近的種和菌株，是目前種及亞種水平鑒定最可信和準(zhǔn)確的方法之一。主要步驟為：根據(jù)16S rDNA和23S rDNA末端的保守序列設(shè)計(jì)引物、對(duì)ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行序列分析。該方法廣泛用于雙歧桿菌的分類鑒定及多態(tài)性研究中。Francesca等研究者利用16S rDNA和16S-23S ITS序列對(duì)人類腸道黏膜和糞便中900個(gè)分離菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了704株雙歧桿菌，主要有長(zhǎng)雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌等6種，在糞便、黏膜等腸道不同環(huán)境中分布有差異[16]。LI等通過表型鑒定、16S rDNA和16S-23S ITS從10株雙歧桿菌中篩選出動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種Qq08菌株，具有耐氧、耐酸和耐膽汁鹽能力，比商業(yè)化益生菌株BB12特性更好[17]。

2.1.2 半保守基因序列分析

除了16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列外，研究者也尋找到其他保守性略低的基因，通過測(cè)序分析，對(duì)菌種進(jìn)行有效區(qū)分。如recA基因中一段300 bp的片段，有足夠的信息可用于雙歧桿菌屬大部分種的區(qū)分，還能對(duì)相近的種如動(dòng)物雙桿桿菌乳亞種和動(dòng)物亞種區(qū)分[18]。 16S rDNA、16S-23S rDNA ITS結(jié)合這些保守基因的序列分析，可在種及亞種水平對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行較精確的分型鑒定。Byoung等提出rpoB基因序列相似度84.1%～99.0%時(shí)，可以作為雙歧桿菌鑒定的有效分子標(biāo)簽[19]。Loredana等利用hsp60基因?qū)﹄p歧桿菌進(jìn)行鑒定，認(rèn)為該基因具有種及亞種水平的分辨力[20]。Sheu等采用tuf基因引物實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵乳中雙歧桿菌部分種的分子鑒定[21]。 另外，還有g(shù)roEL，recA，atpD，dnaK，grpE等基因。但是該類單基因分子尚無(wú)完善的數(shù)據(jù)庫(kù)，不足以提供全面的進(jìn)化分析信息，菌株水平區(qū)分能力不夠；且由于缺乏有效的保守區(qū)域，基于這些基因設(shè)計(jì)種特異分型引物存在一定困難。

2.1.3 多位點(diǎn)測(cè)序分型

多位點(diǎn)測(cè)序分型 (Multilocus Sequence Typing，MLST)技術(shù)是1998年Maiden等提出，近年來(lái)發(fā)展較快的一種分子分型方法[22]。它選擇多個(gè)編碼蛋白的管家基因，進(jìn)行序列測(cè)定，分析等位基因圖譜，進(jìn)行聚類分析，根據(jù)位點(diǎn)序列賦予不同菌株序列型(Sequence type，ST)，對(duì)菌株進(jìn)行多位點(diǎn)的精確分型。最早的MLST序列測(cè)定450 bp，基因個(gè)數(shù)7～10個(gè)，具有較好的分辨能力。與其他方法相比，該技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)序技術(shù)；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好；數(shù)據(jù)能共享、動(dòng)態(tài)補(bǔ)充和互相比較；分型精度可以和PFGE相媲美，達(dá)到菌株水平。目前全球共有4個(gè)較大的公共MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(www.pasteur.fr/mlst，http://pubmlst.org/，http://www.mlst.net/，http://mlst.ucc.ie/)。

關(guān)于雙歧桿菌的MLST研究剛剛起步。2006年，Marco等人選擇7個(gè)保守的管家基因，clpC，dnaB，dnaG，dnaJ1，purF，rpoC和xfp，對(duì)雙歧桿菌常見種的模式菌株進(jìn)行進(jìn)化分析，比較7個(gè)基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果比單基因建樹結(jié)果更全面、合理[12]。2010年，Alexis等研究者對(duì)119株動(dòng)物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌進(jìn)行clpC、purF等7個(gè)管家基因的MLST分析，共獲得104個(gè)ST型別，在兩歧雙歧、長(zhǎng)雙歧、短雙歧種間區(qū)分度達(dá)到99%，具有精確菌株分型的能力[23]。 2011年，Hiroshi利用MLST和AFLP技術(shù)對(duì)母體中長(zhǎng)雙歧桿菌轉(zhuǎn)移到嬰兒體內(nèi)的過程進(jìn)行溯源分析[24]。鑒于MLST方法能綜合多個(gè)管家基因的進(jìn)化信息、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作等諸多優(yōu)點(diǎn)，有望成為雙歧桿菌進(jìn)化分析的強(qiáng)有力的工具。

2.2 DNA印跡方法

2.2.1 直接針對(duì)基因組的DNA印跡方法

(1)脈沖場(chǎng)凝膠電泳。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是目前菌株鑒定，包括雙歧桿菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)方法。其操作步驟為：細(xì)菌培養(yǎng)后在瓊脂糖凝膠塊中裂解，用稀有酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶作用，脈沖場(chǎng)凝膠電泳分離。DNA帶譜反映了目標(biāo)基因組特異的序列分布，可以作為分型的依據(jù)。該方法能反映雙歧桿菌全基因組中較多的變異信息，具有重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，比16S rDNA方法分辨力更高，具備菌株水平溯源能力，是菌株多相鑒定技術(shù)的常用方法之一。

PFGE自1996年用于雙歧桿菌的分型鑒定中。2006年，Briczinski等改進(jìn)了雙歧桿菌PFGE技術(shù)的條件，大大縮短了該方法的操作時(shí)間[25]。Marius等對(duì)市售益生菌乳制品中的雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，并用PFGE分析對(duì)包括酸乳在內(nèi)的乳制品中雙歧桿菌鑒定，發(fā)現(xiàn)所有分離菌株和BB12等3個(gè)商業(yè)菌株譜型一致，均為動(dòng)物雙歧桿菌，推測(cè)不同名稱的商業(yè)菌株可能來(lái)源相同[26]。Kheadr等利用PFGE法對(duì)14株母乳喂養(yǎng)新生兒體內(nèi)分離的雙歧桿菌進(jìn)行分子鑒定，16S rDNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些分離株與thermacidophilum豬亞種有98%-99%的相似性，進(jìn)一步用PFGE分析將其分為4種酶切圖譜，認(rèn)為該類亞種在新生兒體內(nèi)的存在將幫助形成嬰兒的腸道生境[27]。Aires等利用PFGE和BOX-PCR對(duì)15個(gè)嬰兒體內(nèi)動(dòng)態(tài)收集4次獲得的雙歧桿菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同嬰兒體內(nèi)有不同的雙桿桿菌優(yōu)勢(shì)菌種，隨著時(shí)間而變化，利用該法可以對(duì)嬰兒體內(nèi)雙歧桿菌菌群分布進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，用于調(diào)節(jié)嬰兒飲食方案[28]。但PFGE的不足為操作復(fù)雜、步驟繁瑣、需要特殊設(shè)備和易受操作者經(jīng)驗(yàn)影響，是該法的應(yīng)用限制。

(2)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP) 于1980年最先提出，是發(fā)展最早的DNA印跡技術(shù)之一。主要步驟為：限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、探針標(biāo)記特定DNA片段。DNA片段數(shù)目和長(zhǎng)度反映了DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布。是可用于種間鑒定的一種DNA指紋方法。

目前，傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)使用較少，常與PCR聯(lián)用，稱為PCR-RFLP。即先針對(duì)16S rDNA或其他靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，再對(duì)擴(kuò)增片段酶切，從而把不同多態(tài)性的菌株序列區(qū)分開來(lái)。該方法既利用了PCR的片段選擇特異性，又發(fā)揮了RFLP對(duì)多態(tài)性的分析能力，比單個(gè)技術(shù)的分辨力要高。Loredana等建立了一種針對(duì)hsp60基因的PCR-RFLP方法，先用引物擴(kuò)增hsp60基因中一段590 bp的片段，而后用HaeⅢ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，能對(duì)25個(gè)雙歧桿菌不同的種，以及動(dòng)物雙歧、假長(zhǎng)雙歧桿菌的部分亞種進(jìn)行區(qū)分[20]。還有一種新的非培養(yǎng)的低分辨群落分析技術(shù)也基于RFLP，稱為T-RFLP。該方法在擴(kuò)增引物的一端加上熒光標(biāo)記，對(duì)目標(biāo)序列擴(kuò)增后再酶切，而后用專門的讀圖設(shè)備分析鋒形，與模式菌株純培養(yǎng)制備的鋒形比較，通過軟件的計(jì)算獲得混合樣本中的細(xì)菌群落分布情況，分型水平到屬或?qū)僖韵?。Fei Sjoberg等利用T-RFLP技術(shù)和培養(yǎng)方法比較分析了部分出生1周到12個(gè)月的嬰兒糞便，認(rèn)為T-RFLP方法對(duì)不可培養(yǎng)厭氧菌種的檢測(cè)更加穩(wěn)定，為一種靈敏、具備合適區(qū)分力的腸道微生物組成分析方法[29]。

2.2.2 基于PCR的DNA印跡方法

(1)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)是由WILLIAMS和WELSH同時(shí)發(fā)展起來(lái)的一種DNA標(biāo)記技術(shù)。其原理是針對(duì)目標(biāo)菌株基因組DNA，以單一的隨機(jī)寡核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段經(jīng)凝膠電泳分離后呈現(xiàn)出DNA指紋圖譜，分析基因組多態(tài)性特征對(duì)菌株分類鑒定。RAPD技術(shù)可在基因組序列未知的情況下進(jìn)行，設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，在雙歧桿菌鑒定中應(yīng)用廣泛。

董明盛采用RAPD技術(shù)，用10條引物對(duì)7種9株雙歧桿菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)引物S256對(duì)雙歧桿菌種及同種不同株均具有良好的區(qū)分能力，由擴(kuò)增圖譜建立的聚類樹狀圖能準(zhǔn)確反映雙歧桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[30]。Hidenori等研究者用RAPD技術(shù)對(duì)母親和哺乳嬰兒體內(nèi)分離的各50株短雙歧桿菌進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)部分母體短雙岐桿菌轉(zhuǎn)移到嬰兒體內(nèi)，成為嬰兒腸道早期定植菌，具有更高的生長(zhǎng)活力[31]。但早期的RAPD引物為非特異性，擴(kuò)增受到PCR條件等多重因素影響，重復(fù)性和穩(wěn)定性相對(duì)較低。近年來(lái)，研究者篩選更多的RAPD引物，挑選出菌株特異的區(qū)分引物，提高了傳統(tǒng)RAPD方法的分型精度，達(dá)到菌株水平。如Toshimitsu等篩選了97對(duì)RAPD引物，挑選出能特異區(qū)分兩歧雙歧桿菌OLB6378的菌株特異性RAPD引物，可用于該特定菌株的檢測(cè)和計(jì)數(shù)[32]。

(2)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)是一種建立在PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上的檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子分型技術(shù)。其主要步驟為：先對(duì)基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切；將含有粘性末端的接頭與酶切片段連接，作為擴(kuò)增模板；以特異接頭序列作為引物PCR，獲得不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段；凝膠電泳分離后對(duì)圖譜分析進(jìn)行菌種鑒定。該技術(shù)既具有RAPD技術(shù)的高效性和方便性，又兼顧RFLP技術(shù)的可靠性和重復(fù)性，能對(duì)部分遺傳關(guān)系相近的雙歧桿菌進(jìn)行區(qū)分。Dimitrov利用XhoⅠ和TaqⅠ兩個(gè)酶，建立了一種具有高度菌株特異性的AFLP分型方法，對(duì)20個(gè)分離自健康人體的雙歧桿菌鑒定，結(jié)果比PFGE的分辨力更高，操作也更簡(jiǎn)便[33]。Hiroshi等利用AFLP和MLST方法，對(duì)8對(duì)母親和嬰兒的長(zhǎng)雙歧桿菌進(jìn)行追溯，發(fā)現(xiàn)其中11個(gè)長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)雙歧亞種在母親和嬰兒的糞便中是同型的，這些菌株從出生后就定植在嬰兒的腸道內(nèi)，具有母體-嬰兒的家族特異性[24]。

(3)細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)。

細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù) (Repetitive DNA element PCR，Rep PCR)是1996年首先提出，主要原理是對(duì)細(xì)菌DNA中廣泛分布的短重復(fù)序列 (長(zhǎng)度從30-40bp到150bp不等)擴(kuò)增，電泳分析產(chǎn)物條帶，從而揭示基因組DNA之間的差異。主要有基因外重復(fù)回文系列(Repetitive Extragenic Palindromic，REP)、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列 (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)和BOX插入因子等幾類。Rep-PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單，分辨效果好，可自動(dòng)化，并可建立菌種REP-PCR、ERIC-PCR分型數(shù)據(jù)庫(kù)，近年來(lái)發(fā)展較快，也有學(xué)者將其應(yīng)用于雙歧桿菌分類鑒定中。

Ventura等利用ERIC-PCR對(duì)26個(gè)菌種的89個(gè)菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該方法能對(duì)大部分菌種有效區(qū)分，但對(duì)相近的種區(qū)分力較低，如鏈狀雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌[34]。Masco等用BOX-PCR技術(shù)對(duì)128個(gè)雙歧桿菌模式菌株、參考菌株和分離菌株鑒定，發(fā)現(xiàn)BOXA1R引物的區(qū)分力最佳，能在種和亞種水平，部分甚至在菌株水平鑒定，重現(xiàn)率高達(dá)92.5%～97%[35]。Waligora等利用Masco建立的BOX-PCR和多重PCR方法，對(duì)10個(gè)法國(guó)過敏癥嬰兒和20個(gè)對(duì)照者的胎糞中菌群分析，發(fā)現(xiàn)兩組嬰兒的菌種構(gòu)成無(wú)明顯差別，都有大量的雙歧桿菌分布，雙歧桿菌的多樣性和過敏狀態(tài)之間無(wú)明顯關(guān)聯(lián)[36]。

3 結(jié)束語(yǔ)

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，雙歧桿菌作為益生菌的一大類，已用于多種食品的開發(fā)，包括嬰幼兒配方乳粉。因?yàn)橐嫔饔镁哂芯晏禺愋裕_的菌株鑒定技術(shù)不僅是各國(guó)學(xué)者研究的重點(diǎn)，也將成為我國(guó)益生菌食品安全監(jiān)管的必然需求。傳統(tǒng)的生理生化技術(shù)已經(jīng)不能滿足精確的分型鑒定要求，但仍然作為標(biāo)準(zhǔn)方法用于培養(yǎng)和初步分型。各種分子生物學(xué)技術(shù)成為雙歧桿菌分型鑒定的主流方法。

未來(lái)的雙歧桿菌分類鑒定中，基因組序列的直接測(cè)定將成為重要的發(fā)展方向，特殊半保守基因序列分析將成為16S rDNA序列分型的有力補(bǔ)充。MLST技術(shù)因?yàn)楹w更多的基因信息和易于全球共享數(shù)據(jù)的模式，在雙歧桿菌鑒定和相關(guān)研究中的應(yīng)用將更廣泛。傳統(tǒng)的DNA印跡方法對(duì)于基因組中較大的差異有全局反映，但不能提供菌種以下的分辨力，應(yīng)用將受到局限?；诩?xì)菌特異重復(fù)序列的rep-PCR以及改良過的DNA印跡方法如特異菌株位點(diǎn)RAPD、AFLP技術(shù)具有亞種或菌株水平的分辨力，將成為PFGE方法的優(yōu)良候選。隨著雙歧桿菌基因組數(shù)據(jù)的不斷擴(kuò)充，比較基因組分析將有助于開發(fā)精確的菌株鑒定技術(shù)，二代測(cè)序技術(shù)將在復(fù)雜生境下菌群快速分析中發(fā)揮更重要的作用。但無(wú)論哪一種方法，都應(yīng)當(dāng)與其他方法互為補(bǔ)充，取長(zhǎng)補(bǔ)短，多相分型依然是重要的分型鑒定思路。

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