牛靜亞 張 睿 許順江

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院中心實驗室，河北 石家莊 050031)

目前，全世界有2 000多萬阿爾茨海默病(AD)患者，尚無特效治療或逆轉(zhuǎn)病情的藥物。AD的病因極其復(fù)雜，一般認為與遺傳、環(huán)境及二者相互作用有關(guān)，并且發(fā)病機制還不十分明確。MicroRNA是一種長度為20～24個核苷酸的5′端帶磷酸基團、3′端帶羥基的內(nèi)源性非編碼小RNA，在生物體內(nèi)具有重要作用。miRNAs不僅參與生理過程的調(diào)控，在疾病的發(fā)生以及機體對藥物的反應(yīng)等生命過程中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可通過多種途徑影響疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。利用生物信息學的方法估計生物體內(nèi)約有三分之一編碼蛋白的基因受miRNAs的調(diào)控〔1〕。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類miRNAs超過1 400個(miRBase Release 17)，它們在生物體內(nèi)既是代謝產(chǎn)物，也是機體有目的編碼的重要調(diào)控分子。因此，miRNAs調(diào)控紊亂可能是人體多種疾病發(fā)生的潛在因素。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs可能參與了AD的發(fā)生發(fā)展過程，本文概述miRNAs在AD發(fā)病中的研究進展及前景。

1 miRNAs的生物合成及其在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能

miRNAs對器官發(fā)育和細胞穩(wěn)態(tài)十分重要，主要包括外顯子miRNAs和內(nèi)含子miRNAs。外顯子miRNAs，例如let-7和lin-4，首先由細胞核內(nèi)編碼miRNAs的基因轉(zhuǎn)錄成pri-microRNAs，然后被Drosha酶剪切成長約70 bp的發(fā)夾狀pre-miRNAs，接著被轉(zhuǎn)運蛋白(Exportin-5)從核內(nèi)轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)中，Dicer酶將其剪切成長約22 bp的成熟miRNAs:miRNAs*，其中miRNAs鏈被RNAase降解，另一條鏈與Argonaute蛋白緊密結(jié)合，形成非對稱的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)復(fù)合物(RNA-induced silencing complex)，該復(fù)合物中的miRNAs以特異或非特異的方式與其靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，從而引起靶基因的降解或翻譯抑制。與外顯子miRNAs不同，內(nèi)含子miRNAs在mRNA的內(nèi)含子加工過程中產(chǎn)生，但二者的作用方式相同。miRNAs幾乎調(diào)控機體的每一個生理過程，并且調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜。一種miRNAs可調(diào)控上百種靶基因的表達。反之，一種mRNA也可同時接受若干種miRNAs的協(xié)同調(diào)節(jié)。

miRNAs廣泛存在真核生物中，尤其在哺乳動物及嚙齒類動物腦中含量相當豐富，在進化上具有高度保守性、時序性和組織特異性。miRNAs參與了神經(jīng)元的生長、分化等多個生理過程。例如，miR-134在海馬神經(jīng)元的突觸中表達，通過抑制單絲氨酸蛋白激酶1(LIMK1)的翻譯調(diào)控突觸可塑性〔2〕。miR-30a-5p在人類額前皮質(zhì)椎體神經(jīng)元中表達豐富，可負性調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達〔3〕。Abdelmohsen等〔4〕發(fā)現(xiàn)miR-375通過負性調(diào)控RNA結(jié)合蛋白HuD的表達影響神經(jīng)元的分化。由于miRNAs參與了腦細胞的分化、發(fā)育、凋亡等各種生理過程，大腦中任何miRNAs的異常表達都可能影響神經(jīng)元的存活和它對神經(jīng)退行性變的抵抗作用，而通過調(diào)控這些異常表達miRNAs則可能達到治療疾病的目的。

2 miRNAs在AD發(fā)生中的調(diào)控作用

AD是一種進行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，病變最易累及與高級認知功能有關(guān)的腦區(qū)，特別是新皮質(zhì)和海馬，臨床表現(xiàn)為認知和記憶功能進行性惡化，日常生活能力不斷減退，常伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。目前主要是通過膽堿酶抑制劑、精神類藥物結(jié)合家庭護理和理療進行治療，但并不能抑制疾病的進一步發(fā)展。目前，有大量研究表明miRNAs參與了AD的發(fā)病過程并有可能起著關(guān)鍵作用。Bilen等〔5〕在整體水平采用突變果蠅dicer1基因的手段和離體水平siRNA干擾HeLa細胞中dicer1蛋白表達的方法抑制miRNAs成熟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病理性Tau蛋白或多聚谷氨酰胺(polyQ)誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性損害加重，說明miRNAs在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用，但miRNAs的具體調(diào)節(jié)機制還不甚明了。

2.1AD病變的共同病理特征 AD的神經(jīng)病理改變主要是腦皮質(zhì)彌漫性萎縮、溝回增寬、腦室擴大，組織病理改變主要是皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)、含有β-淀粉樣肽(Aβ)的老年斑(SP)的出現(xiàn)、相關(guān)腦區(qū)(基底前腦、海馬和新皮層等)內(nèi)神經(jīng)突觸和錐體神經(jīng)元消失、腦血管淀粉樣改變等。NFT的發(fā)生主要由于Tau蛋白的磷酸化，SP的淀粉樣沉積物主要成分是Aβ，而Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β分泌酶(BACE)1/γ-分泌酶分解而來，諸多學者認為Aβ在AD的發(fā)病機制中起著十分重要的作用。

2.2miRNAs對AD主要致病基因的調(diào)控 APP蛋白在細胞內(nèi)以跨膜受體的結(jié)構(gòu)形式存在，包括一條較長的細胞外N末端和一條較短的細胞內(nèi)C末端。APP蛋白可能對神經(jīng)元的可塑性、神經(jīng)元的生長和神經(jīng)突外生有重要作用。APP蛋白有三個主要亞型，分別由APP基因外顯子7、8和15的選擇性剪切產(chǎn)生。正常神經(jīng)元的APP基因僅包括外顯子15，而缺乏外顯子7和8，但在AD患者大腦中發(fā)現(xiàn)由APP基因外顯子7和8編碼的蛋白增多。Smith 等〔6〕最近研究證明，正常人腦中miR-124通過抑制PTBP1的表達，促進APP基因外顯子7和8的選擇性剪切。而AD病人腦中miR-124的表達明顯減少，致使APP基因外顯子7和8的選擇性剪切減少，神經(jīng)元中APP蛋白亞型大量增多。最近Liu等〔7〕發(fā)現(xiàn)，SAMP8鼠的大腦中APP蛋白表達量明顯增多，但其mRNA卻沒有明顯變化，提示存在APP的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。他們利用miRanda軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)APP mRNA的3′-UTR存在miR-16的結(jié)合位點，并進一步驗證了miR-16對SAM鼠內(nèi)源性APP的負性調(diào)控作用。Vilardo等〔8〕通過定位誘變研究發(fā)現(xiàn)，APP基因的3′-UTR存在miR-101的識別位點，miR-101表達的減少可導(dǎo)致APP蛋白的表達增多，從而影響Aβ的沉積。APP mRNA的3′-UTR不僅存在miR-101的直接作用靶點還存在miR-106a，miR-520c〔9〕和miR-20家族〔10〕的直接作用靶點。綜上，作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，miRNAs在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用，特定miRNAs異常表達可能影響APP基因或蛋白的表達，從而促進AD的發(fā)生或惡化。但是，某一靶基因的表達又受多個miRNAs的調(diào)控，疾病發(fā)生過程中各種miRNAs之間又存在著怎樣一種制約與協(xié)同關(guān)系還有待進一步研究。

Aβ是由39～43個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，為APP經(jīng)BACE1/β分泌酶水解產(chǎn)物，是構(gòu)成SP核心和血管壁沉積物的主要成分。Aβ的逐漸積累是AD發(fā)生的主要原因，而Aβ的異常沉積除了與APP表達增多關(guān)系密切外，還與BACE1的異常表達密不可分。Wang等〔11〕通過對不同階段的AD患者大腦中異常表達的miRNAs研究發(fā)現(xiàn)，miR-107在AD發(fā)病早期表達即明顯下降，并且miR-107可能通過負性調(diào)控BCAE1蛋白的表達影響AD的病理進程。同時，Hébert等〔12〕在散發(fā)的AD患者腦中觀察到，miR-29a/b和BCAE1蛋白的表達呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)，且BCAE1 mRNA的3′-UTR存在miR-29a/b的結(jié)合位點，在APP mRNA的3′-UTR存在let-7、miR-15a、miR-101和miR-106b的結(jié)合位點，而所有這些miRNAs在AD病人的腦中表達量均下降。此外，他們還在細胞水平驗證了miR-29a/b對內(nèi)源性BCAE1蛋白的負性調(diào)控作用。Boissonneault等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)miR-298和miR-328可負性調(diào)控BACE1蛋白的表達，但其在老齡化的APPswe/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬表達量卻明顯降低。綜上，多個miRNAs均可負性調(diào)控BCAE1蛋白的表達，特定的miRNAs表達異常均有可能導(dǎo)致BCAE1蛋白表達增多，從而促進Aβ的沉積和AD的發(fā)生。

微管是神經(jīng)細胞骨架成分，由微管蛋白及微管相關(guān)蛋白組成，參與多種細胞功能。tau基因位于17號染色體長臂，其表達產(chǎn)物是含量最高的微管相關(guān)蛋白。正常人腦中Tau蛋白有6種同功異構(gòu)體，僅含有2～3個磷酸基。而AD患者腦的Tau蛋白過度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9個磷酸基，并喪失正常生物功能。近年來，有關(guān)miRNAs對AD病人腦中Tau蛋白磷酸化的影響也有了進一步的研究。ERK1是Tau蛋白磷酸化過程中的重要調(diào)控因子，miR-15家族通過負性調(diào)控ERK1的表達影響Tau蛋白磷酸化的過程，但在AD患者的腦中miR-15家族的表達量卻明顯減少，進一步證明了miRNAs在AD發(fā)病過程中的重要調(diào)控作用〔14〕。同時，也有研究證明，miR-128參與Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因(BAG)2/熱休克蛋白(HSP)70復(fù)合物對不溶性Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的清除〔15〕。綜上，多種miRNAs參與了AD的發(fā)病過程，但是其調(diào)控又具有一定的復(fù)雜性，miRNAs能否如患者腦脊液中的Aβ、總Tau蛋白及磷酸化的Tau蛋白等分子一樣作為AD早期診斷的分子標志，尚待進一步的研究。

2.3miRNAs對AD其他非特異性致病因子的調(diào)控 AD的發(fā)病是一個極其復(fù)雜的過程，miRNAs除了對特異性致病基因(APP、Aβ、tau)有調(diào)控作用外，對其他致病因子也具有重要調(diào)控作用。Sethi等〔16〕發(fā)現(xiàn)miR-146a受核因子(NF)-κB的直接調(diào)控，而miR-146可以通過負性調(diào)控補體因子H的表達以對抗大腦的炎癥反應(yīng)進而影響AD進展。Yao等〔17〕通過研究AD模型鼠發(fā)現(xiàn)，miR-103和miR-107抑制肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin的表達，二者表達水平的降低會導(dǎo)致肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin的表達過量，進而影響細胞結(jié)構(gòu)骨架的變化，使神經(jīng)細胞更易受損。Wang等〔18〕通過對APPswe/PS△E9轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β二型受體(TβR Ⅱ) mRNA的3′-UTR存在miR-106b的作用位點，miR-106b可以負性調(diào)控TβR Ⅱ的翻譯，且通過體外細胞實驗印證了這一結(jié)果。一定程度上說明了TGF-β信號通路在AD發(fā)病過程中起著重要作用。綜上，miRNAs的表達異常不僅對AD發(fā)病過程中的標志性蛋白的表達有影響，而且會通過影響其他致病因子的表達導(dǎo)致細胞信號通路的改變，而這些改變都有助于AD的發(fā)生。

3 存在的問題及展望

目前對于miRNAs在AD發(fā)病機制中的作用已取得了一定的進展，但仍存在一定的局限性和挑戰(zhàn)：①每種miRNAs可作用于多個靶基因，僅集中與一種靶基因的研究無疑忽視了miRNAs的總體效應(yīng)及各種靶蛋白的協(xié)同作用。②每個靶基因可能受多種miRNAs調(diào)控，僅集中于一種miRNAs的影響，可能混淆生物效應(yīng)的真實性。③動物模型對疾病發(fā)病機制的研究具有重要價值，但是由于人體的復(fù)雜性其結(jié)果并不能直接用于人體。④每一種miRNAs可在多大程度上調(diào)控哪些靶蛋白的表達還有待進一步研究。⑤細胞內(nèi)miRNAs的自身調(diào)控及反饋調(diào)控及確定調(diào)控miRNAs的機制還需深入探討。

miRNAs的廣泛發(fā)現(xiàn)及其對腦組織發(fā)育、神經(jīng)細胞分化、突觸功能的影響，使人們對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認識更進一步，篩選與疾病相關(guān)的miRNAs及其靶基因和相應(yīng)的蛋白表達的改變?nèi)詫⑹窃擃I(lǐng)域的研究熱點。隨著人類對miRNAs研究的不斷深入，miRNAs和疾病之間的關(guān)系可能更加明了，miRNAs可能成為疾病診斷新的生物學標記，鑒于miRNAs在AD發(fā)病機制中的作用還有待于進一步揭示，利用寡核苷酸抑制高表達的miRNAs或miRNAs干擾某些致病基因的過量表達有望成為疾病治療的新途徑。

4 參考文獻

1Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA target〔J〕.Cell，2005;120(1)：15-20.

2Schratt GM，Tuebing F，Nigh EA,etal.A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development〔J〕.Nature，2006;439 (7074)：283-9.

3Mellios N，Huang HS，Grigorenko A,etal.A set of differentially expressed miRNAs，including miR-30a-5p，act as post-transcriptional inhibitors of BDNF in prefrontal cortex〔J〕.Hum Mol Genet，2008;17(19)：3030-42.

4Abdelmohsen K，Hutchison ER，Lee EK,etal.miR-375 inhibits differentiation of neurites by lowering HuD levels〔J〕.Mol Cell Biol，2010；30(17)：4197-210.

5Bilen J，Liu N，Burnett BG,etal.MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration〔J〕.Mol Cell，2006;24 (1)：157-63.

6Smith P，Al Hashimi A，Girard J,etal.In vivo regulation of amyloid precursor protein neuronal splicing by microRNAs〔J〕.J Neurochem，2011;116(2):240-7.

7Liu W，Liu C，Zhu J,etal.MicroRNA-16 targets amyloid precursor protein to potentially modulate Alzheimer′s-associated pathogenesis in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，2010;33(3):522-34.

8Vilardo E，Barbato C，Ciotti M,etal.MicroRNA-101 regulates amyloid precursor protein expression in hippocampal neurons〔J〕.J Biol Chem，2010;285(24)：18344-51.

9Patel N，Hoang D，Miller N,etal.MicroRNAs can regulate human APP levels〔J〕.Mol Neurodegener，2008;6：3-10.

10Hébert SS，Horré K，Nicola L,etal.MicroRNA regulation of Alzheimer′s amyloid precursor protein expression〔J〕.Neurobiol Dis，2009;33(3)：422-8.

11Wang WX，Rajeev BW，Stromberg AJ,etal.The expression of microRNA miR-107 decreases early in Alzheimer′s disease and may accelerate disease progression through regulation of beta-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1〔J〕.J Neurosci，2008;28(5):1213-23.

12Hébert SS，Horré K，Nicola? L,etal.Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 in sporadic Alzheimer′s disease correlates with increased BACE1/beta-secretase expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2008;105(17)：6415-20.

13Boissonneault V，Plante I，Rivest S,etal.MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse β-amyloid precursor protein-converting enzyme 1〔J〕.J Biol Chem，2009;284(4):1971-81.

14Hébert SS，Papadopoulou AS，Smith P,etal.Genetic ablation of Dicer in adult forebrain neurons results in abnormal tau hyperphosphorylation and neurodegeneration〔J〕.Hum Mol Genet， 2010;19(20)：3959-69.

15Carrettiero DC，Hernandez I，Neveu P,etal.The cochaperone BAG2 sweeps paired helical filament- insoluble tau from the microtubule〔J〕.J Neurosci，2009;29(7):2151-61.

16Sethi P，Lukiw WJ.Micro-RNA abundance and stability in human brain：specific alterations in Alzheimer′s disease temporal lobe neocortex〔J〕.Neurosci Lett，2009;459(2):100-4.

17Yao J，Hennessey T，F(xiàn)lynt A,etal.MicroRNA-related cofilin abnormality in Alzheimer′s disease〔J〕.PLoS One，2010;5(12):e15546.

18Wang H，Liu J，Zong Y,etal.miR-106b aberrantly expressed in a double transgenic mouse model for Alzheimer′s disease targets TGF-β type Ⅱ receptor〔J〕.Brain Res，2010;1357:166-74.