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（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032；2.　揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州　832000）

布魯氏菌弱毒疫苗鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

南文龍1，譚鵬飛1，2，彭大新2，陳義平1

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州832000）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種重要的人畜共患傳染病，不僅給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并威脅人類健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，但弱毒疫苗的使用往往對(duì)布病的診斷和監(jiān)測(cè)造成干擾。各國(guó)學(xué)者利用細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，建立了病原分離鑒定、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、利凡諾爾試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光偏振實(shí)驗(yàn)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、PCR、real-timePCR等多種布魯氏菌弱毒疫苗鑒別檢測(cè)方法。研究表明，ELISA和FPT以其高通量以及操作方便的優(yōu)勢(shì)，在布魯氏菌弱毒疫苗與野生菌株感染的血清學(xué)鑒別診斷方面前景良好；分子生物學(xué)特別是PCR、real-timePCR方法目前仍廣泛用于布魯氏菌純培養(yǎng)物的鑒定。

布魯氏菌；弱毒疫苗；鑒別；疫苗免疫；研究進(jìn)展

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的人畜共患傳染病。布魯氏菌可感染人和多種家畜、野生動(dòng)物，對(duì)畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全均構(gòu)成威脅[1]。近年來(lái)，布病疫情在世界范圍內(nèi)呈反彈趨勢(shì)，2011年我國(guó)布病發(fā)病人數(shù)為38151人，為歷年新高[2]。疫苗免疫是防控布魯氏菌病的主要措施之一，布魯氏菌弱毒疫苗免疫效果好、免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、成本較低，布魯氏菌弱毒疫苗的推廣應(yīng)用在布病防控過(guò)程中發(fā)揮了積極作用。當(dāng)前，國(guó)外常用的弱毒疫苗株包括S19、RB51、Rev.1；中國(guó)常用的弱毒疫苗株包括A19、S2、M5、104M，但弱毒疫苗的使用往往對(duì)布魯氏菌病的診斷和監(jiān)測(cè)造成干擾。各國(guó)學(xué)者利用細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，從病原和血清抗體兩方面，建立了多種布魯氏菌弱毒疫苗株與野生菌株的鑒別檢測(cè)方法，本文就相關(guān)研究進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1　細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法

病原分離鑒定是診斷布魯氏菌病的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于布魯氏菌種和生物型的鑒定。但由于布魯氏菌生長(zhǎng)緩慢，所需營(yíng)養(yǎng)條件復(fù)雜，分離培養(yǎng)需在P2級(jí)以上生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且細(xì)菌學(xué)方法不能有效鑒別與疫苗株同生物型的野生分離株，該方法應(yīng)用于布魯氏菌疫苗株的鑒別具有局限性。

2　免疫學(xué)檢測(cè)方法

2.1補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complementfxationtest，CFT）

CFT最早應(yīng)用于布魯氏菌弱毒疫苗鑒別的檢測(cè)方法，原理是基于弱毒疫苗免疫和野生菌株感染后產(chǎn)生的特異性IgG和IgM抗體具有產(chǎn)生量、時(shí)相的差別。Allangs等[3]分別用布魯氏菌弱毒疫苗和野生菌株接種豚鼠，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫接種后，大約5天產(chǎn)生IgM抗體，2周后可達(dá)高峰，IgG抗體在4周左右達(dá)高峰，以后逐漸下降；而野生菌株接種后，IgM抗體很快下降，IgG抗體的高峰期可維持270天，1年后仍能維持在可檢測(cè)水平。血清抗體IgG的長(zhǎng)期持續(xù)存在，也是慢性布魯氏菌感染病例的一項(xiàng)指征[4]。由于CFT主要檢測(cè)IgG類抗體，應(yīng)用于布魯氏菌弱毒疫苗免疫和野生菌株感染的鑒別，需要多次采集血清樣品進(jìn)行檢測(cè)與比較，耗時(shí)較長(zhǎng)，操作過(guò)程較為繁瑣。

2.2利凡諾爾試驗(yàn)（rivanoltest，RIV）

RIV是重要的布魯氏菌弱毒疫苗鑒別方法，應(yīng)用乙氧基-6，9-二氨基吖啶黃乳酸鹽作為還原物質(zhì)，沉淀消除血清中IgM類抗體和血清白蛋白，而保留IgG類抗體。經(jīng)利凡諾爾處理的血清，處理前后血清抗體滴度不發(fā)生明顯變化，說(shuō)明血清中主要是IgG類抗體；處理前后血清抗體滴度下降明顯，說(shuō)明血清中含有大量IgM類抗體，可能是疫苗免疫接種所致，可做疫苗免疫與野生菌株感染鑒別的參考依據(jù)。Heck等[5]對(duì)863份S19疫苗免疫牛血清和非免疫牛血清共4551份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果RIV與CFT符合率達(dá)到91%～100%。與CFT相比，在慢性布魯氏菌病血清學(xué)診斷方面，RIV簡(jiǎn)便易行，適用于基層檢疫。國(guó)內(nèi)學(xué)者利用RIV方法對(duì)M5疫苗免疫和野生菌株感染血清進(jìn)行了有效區(qū)分[6]。

2.3二巰基乙醇凝集試驗(yàn)與L-半胱氨酸凝集試驗(yàn)

二者均是用適當(dāng)濃度的巰基化合物破壞IgM抗體的雙硫鍵，從而失去凝集活性，而小分子IgG抗體則不受影響，從而區(qū)別布魯氏菌弱毒疫苗免疫與野生菌株感染。閻守敦等[7]應(yīng)用該方法對(duì)Rev.1、M5疫苗免疫和野生菌株感染血清實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分。L-半胱氨酸凝集法操作簡(jiǎn)單，可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行，方便現(xiàn)地診斷[8]。

2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于建立ELISA方法進(jìn)行布魯氏菌弱毒疫苗免疫和野生菌株感染的鑒別，技術(shù)形式包括間接ELISA（indirectELISA，iELISA）、 競(jìng) 爭(zhēng)ELISA（competitiveEILSA，cELISA）、夾心ELISA（sandwichELISA，sELISA）等，技術(shù)原理可分如下三類：

2.4.1粗糙型的布魯氏菌弱毒疫苗由于O-多糖的缺失，其免疫血清與O-多糖抗原沒有反應(yīng)性或反應(yīng)性較小，可以通過(guò)ELISA方便的實(shí)現(xiàn)其鑒別，如對(duì)RB51疫苗[9]。

2.4.2根據(jù)特異性IgG和IgM抗體產(chǎn)生量、時(shí)相、反應(yīng)性的差別，可以通過(guò)ELISA實(shí)現(xiàn)光滑型的布魯氏菌弱毒疫苗鑒別。布魯氏菌S19疫苗免疫后，機(jī)體迅速清除病原，IgG抗體高峰出現(xiàn)后即迅速下降。基于此，Nielsen等[10]以多糖作為抗原，建立了iELISA、cELISA方法，可以區(qū)分S19免疫與自然感染血清。但若出現(xiàn)S19持續(xù)感染的情況，則無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。與iELISA相比，cELISA方法因能區(qū)分耶爾森菌O:9抗原引起的假陽(yáng)性結(jié)果，而更具優(yōu)勢(shì)。閻守敦等[7]建立了改良的ELISA方法，對(duì)被檢血清先用2-巰基乙醇處理后再進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用該方法和試管凝集試驗(yàn)平行檢測(cè)疫苗免疫羊血清1366份，結(jié)果顯示改良ELISA檢測(cè)結(jié)果均為陰性，而試管凝集試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率為39%。證實(shí)該方法可用于鑒別M5疫苗免疫與野生菌株感染血清。布魯氏菌慢性感染過(guò)程中，會(huì)伴隨著特定IgG亞型—高水平IgG2類抗體的持續(xù)存在。Ana[11]等根據(jù)蛋白A對(duì)IgG2具有高度的親和能力，蛋白G可同時(shí)結(jié)合IgG1和IgG2兩種亞類抗體的特點(diǎn)，以S-LPS作為包被抗原，分別應(yīng)用蛋白A或G耦聯(lián)過(guò)氧化物酶作為二抗，建立了iELISA方法，該方法可以將S19疫苗免疫血清與自然感染血清進(jìn)行有效區(qū)分。

2.4.3針對(duì)布魯氏菌全菌或組分制備單克隆抗體，利用單抗的高度特異性進(jìn)行可以進(jìn)行鑒別檢測(cè)。Gorrell等[12]用福爾馬林滅活的牛種布魯氏菌544A作為免疫原，獲得單克隆抗體Br.25，該單克隆抗體能與牛種布魯氏菌生物1型和2型結(jié)合，而不能與S19疫苗、豬種布魯氏菌、羊種布魯氏菌及綿羊附睪種布魯氏菌結(jié)合。用該單抗建立夾心ELISA法，結(jié)果顯示大多數(shù)感染牛為陽(yáng)性，而非感染牛、免疫牛及未免疫牛均為陰性。

2.5電泳鑒別試驗(yàn)

布魯氏菌弱毒疫苗免疫和野生菌株感染抗體存在血清球蛋白成分及其含量的差異，可利用電泳技術(shù)將其區(qū)分。閻守敦等[7]將2-巰基乙醇處理后的血清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測(cè)野生菌株接種動(dòng)物的血清512份，弱毒疫苗接種的動(dòng)物血清1120份，健康對(duì)照血清272份。結(jié)果顯示，陰性血清全部表現(xiàn)為3條區(qū)帶，野生菌株接種的陽(yáng)性血清全部表現(xiàn)為4條區(qū)帶，疫苗接種的陽(yáng)性血清全為5條區(qū)帶，證明該方法可用作鑒別疫苗免疫與野生菌株感染血清。

2.6熒 光偏 振 實(shí) 驗(yàn)（fuorescencepolarization test，F(xiàn)PT）

Gall等[13]以熒光素標(biāo)記的流產(chǎn)布魯氏菌O-多糖作為抗原，對(duì)2087份北美野牛血清進(jìn)行FPT檢測(cè)，并與cELISA進(jìn)行比較。結(jié)果表明，cELISA與FPT敏感性分別為89.5%和92.1%；特異性分別為95.5%和99.4%，F(xiàn)PT比cELISA更為敏感特異。而通過(guò)建立合適的cut-off值，F(xiàn)PT可以實(shí)現(xiàn)S19疫苗免疫血清的鑒別。

3　分子生物學(xué)方法

3.1限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragment lengthpolymorphism，RFLP）

Jensen等[14]運(yùn)用核酸內(nèi)切酶XbaI消化布魯氏菌基因組，建立了RB51疫苗與野生菌株的鑒別方法。通過(guò)RFLP，利用Rev.1疫苗omp2基因上限制性內(nèi)切酶PstI多態(tài)性差異或rpsL基因上NciI酶切位點(diǎn)的缺失突變，可實(shí)現(xiàn)Rev.1疫苗和野生菌株的有效鑒別[15-16]。我國(guó)學(xué)者利用該方法，實(shí)現(xiàn)了M5疫苗與羊種強(qiáng)毒株16M的鑒別[17-18]。

3.2多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple-locusvariablenumbertandemrepeatanalysis，MLVA）

姜海等[19]應(yīng)用MLVA聚類分析法，首次對(duì)S2疫苗與17株豬種布魯氏菌生物1型分離株進(jìn)行了基因分型比較。結(jié)果顯示，這17株分離株可分為2個(gè)基因群，其中基因2群又可分為3個(gè)基因型，S2疫苗為基因2群的2型分支，通過(guò)該方法可將S2與其它基因群、基因型的分離株進(jìn)行區(qū)分。

3.3PCR

Vemulapalli等[20]根據(jù)RB51疫苗中IS711元件阻斷編碼O抗原糖基轉(zhuǎn)移酶的wboA基因這一特性，建立了RB51疫苗和野生菌株的PCR鑒別方法。David等[21]建立了可快速鑒別布魯氏菌疫苗株S19、RB51和Rev.1的多重PCR。谷文喜等[22]通過(guò)PCR擴(kuò)增VirB8基因，測(cè)序分析，證實(shí)牛種（544A、A19）和羊種（M5、Rev1）分別各自在相同部位發(fā)生了相同的堿基突變，VirB8基因有可能做為布魯氏菌疫苗株的鑒定分類基因。鐘旗等[23]利用牛種疫苗株A19與其它牛種布魯氏菌株Ery基因序列存在的差異堿基，建立了聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法，結(jié)合運(yùn)用牛種I型菌株鑒別方法，可實(shí)現(xiàn)疫苗株A19與野生菌株的鑒別。

3.4基于單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）的Real-timePCR

Gopaul等[24]對(duì)疫苗株S19、RB51、Rev.1基因組進(jìn)行SNP分析，并依此建立了基于MGB探針的Real-time檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法與已有的分子檢測(cè)方法相比，如PCR、RFLP等，具有更高的檢測(cè)精確性，快速、可靠地實(shí)現(xiàn)了上述3個(gè)疫苗株與野生菌株的鑒別檢測(cè)。

綜上所述，ELISA和FPT以其高通量以及操作方便的優(yōu)勢(shì)，在布魯氏菌弱毒疫苗與野生菌株感染的血清學(xué)鑒別診斷方面，具有良好的應(yīng)用前景。但是對(duì)于未知背景的血清樣品來(lái)說(shuō)，單次檢測(cè)仍不能確切分辨疫苗免疫或野生菌株感染。分子生物學(xué)方法，特別是PCR、real-timePCR，可有效實(shí)現(xiàn)弱毒疫苗與野生菌株的分子鑒別，但是目前仍主要應(yīng)用于布魯氏菌純培養(yǎng)物的鑒定。

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ResearchAdvancesinIdentifcationofAttenuatedBrucella Vaccines

NanWenlong1，TanPengfei1，2，PengDaxin2，ChenYiping1
（1.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，QingdaoShandong266032；2.YangzhouUniversity，YangzhouJiangsu225009）

BrucellosisisacrucialzoonosiscausedbyBrucella.Itisresponsibleforsubstantialeconomiclossesand posesathreattohumanhealthaswell.Immunizationwithattenuatedvaccineshasprovedtobeaneffectivemethodfor itsprevention；however，itmayinterferewithitsdiagnosis.Usingbacteriology，immunologyandmolecularbiology techniques，manyidentifcationassaysforattenuated Brucellavaccineswereestablished，suchaspathogenisolation andidentifcation，complementfxationtest，rivanoltest，ELISA，fuorescencepolarizationtest，restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR，real-timePCRandsoon.Thesestudiesindicatedthatwiththeadvantagesofhigh throughputandeasyoperation，ELISAandFTPhavegoodprospectsinserologicalidentifcationofattenuatedBrucella vaccines.Moreover，molecularbiologicalmethods，especiallyPCRandreal-timePCR，arestillwidelyusedforidentifcationofthepurecultures.

Brucella；attenuatedvaccine；identifcation；vaccine；researchprogress

S851.34

：B

：1005-944X（2014）08-0032-04

青島市科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)計(jì)劃（14-2-4-79-jch）南文龍、譚鵬飛都為第一作者

陳義平