范致星 楊 簡

(三峽大學(xué)心血管病研究所 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科,湖北 宜昌 443003)

缺血性心臟病(IHD)是人類健康的主要殺手，已成為世界第一位的死亡原因〔1〕。當(dāng)IHD發(fā)生發(fā)展時，外周血中心肌肌鈣蛋白(cTn) 、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 等心肌損傷標(biāo)志物就會大量升高，特別是cTn對IHD的早期診斷和治療提供了依據(jù)。但cTn一般在IHD患者具有典型胸痛癥狀3.5 h后才會有明顯的升高，由于這種相對“延遲”的釋放，當(dāng)被檢測出時，心肌可能已經(jīng)發(fā)生不可逆的損傷，因而尋找一種特異性和敏感性高且時間更早的標(biāo)志物具有十分重要的作用〔2〕。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，外周血miRNA可作為潛在的生物標(biāo)志物用于IHD的診斷。本文將闡述外周血miRNA本身的特點，對miRNA在IHD早期診斷及預(yù)后評估中的意義進行綜述。

1 miRNA概述

成熟miRNAs是一類長度約為22nt 廣泛存在于真核生物的非蛋白質(zhì)編碼小RNA，由Dicer 酶對具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA 前體加工后生成。這些非編碼小分子RNA與靶基因mRNA 分子的3'端非編碼區(qū)域(3'UTR) 互補配對后，可以通過降低mRNA 分子穩(wěn)定性和翻譯抑制兩種方式參與靶基因表達調(diào)控〔4〕。第一個miRNA(lin-4)是Lee 等〔5〕于1993 年首先在線蟲中發(fā)現(xiàn)的。截至目前，已發(fā)現(xiàn)了千余種人類miRNA，隨著研究的深入還將有新的miRNA 被發(fā)現(xiàn)。最新研究表明〔3〕，miRNA可穩(wěn)定存在于人類外周血中，作為生物標(biāo)志物用于肌肉損傷(心肌)、炎癥等多種疾病的研究。

1.1體內(nèi)miRNA的分布 一個理想的IHD標(biāo)志物除了對特異性和敏感性的要求外，還應(yīng)具有以下特點〔6〕：①存在易于獲得的樣本中(如血液、尿液)，便于取材；②能在所取樣本中穩(wěn)定存在；③能用相對經(jīng)濟、簡單的方法進行檢測。Hanson 等〔7〕在血液、精液、唾液、陰道分泌物及月經(jīng)血中均檢測到miRNA 的表達。Gilad 等〔8〕對人體尿液、唾液、羊水及胸水檢測時，同樣發(fā)現(xiàn)了大量miRNA的存在。由此可見，體內(nèi)miRNA的分布十分廣泛，但相對而言外周血中的含量更高。Mitchell等〔9〕找到了外周血中存在miRNA的直接證據(jù)，研究者從健康志愿者血漿中提取RNA后，發(fā)現(xiàn)其中93% 是已知的miRNA。這說明以miRNA為IHD生物標(biāo)志物時只需抽血檢測即可。miRNA 釋放進入外周循環(huán)的機制尚不清楚，目前主要考慮有三種不同的途徑:從受損細胞滲透入循環(huán)(例如心肌損傷或心肌梗死后，心肌細胞內(nèi)miRNA 異常表達并釋放到血液循環(huán)中)；由細胞主動分泌入循環(huán)；微泡分泌理論〔10〕。

1.2外周血miRNA的穩(wěn)定性 新近的研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的miRNA 穩(wěn)定性良好〔11〕。Mitchell 等〔9〕發(fā)現(xiàn) miRNA不會被內(nèi)源性RNA 酶降解而穩(wěn)定存在于人血漿中。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)〔12〕，血清中的miRNA 能耐受高溫、凍融、過酸過堿等惡劣的條件且miRNA的種類與性別無關(guān)。Rosenfeld 等〔13〕對經(jīng)甲醛液固定、石蠟包埋多年的標(biāo)本進行提取和檢測，仍然能得到保存完好的miRNA。這些均有利于臨床設(shè)定一個比較固定的參照值進行檢測分析。

1.3外周血miRNA 的檢測 血清和血漿中miRNA 的表達不存在差異，因此在臨床實踐中可通過提取血清或血漿來檢測miRNA。同時,鑒于外周血miRNA的穩(wěn)定性,無論是新鮮血液還是以其他方式保存的血液,均可用于檢測。外周血miRNA 的定性檢測可以采用miRNA 芯片技術(shù)〔9〕。除此之外，還有一系列的定量檢測方法：①利用RNA 提取試劑盒，這種方法能夠方便而快速地從全血、血清或血漿中直接提取RNA進行檢測〔14〕；②實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和莖環(huán)RT-PCR檢測技術(shù)〔15〕。莖環(huán)RT-PCR檢測技術(shù)精確度可在25 pg以內(nèi),且在特異性和敏感性方面更具優(yōu)勢。

2 miRNA 作為IHD生物標(biāo)志物

從臨床角度看，敏感性、特異性更高，峰值時間更早的生物標(biāo)志物有助于改進目前IHD的診治。

2.1miRNA 作為IHD診斷生物標(biāo)志物 外周血中多種miRNA 亞型都會在心臟缺血時發(fā)生濃度的改變。Wang等〔16〕發(fā)現(xiàn)，在IHD的實驗?zāi)Ｐ秃托募∪毖幕颊哐獫{中，miRNA-1、miR-133a、miRNA-499 和miRNA-208 的含量均較對照組或健康志愿者顯著升高，其中miRNA-208對IHD的診斷的敏感性和特異性最高。在IHD患者中，miRNA-208具有90.9%敏感性及100.0%特異性，且在癥狀出現(xiàn)的最初4 h內(nèi)敏感性更高。Wang等〔16〕通過對IHD模型大鼠和IHD患者心肌內(nèi)miRNA 表達規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-208在1 h內(nèi)即可有高表達，3 h時出現(xiàn)峰值，6～12 h后逐漸下降，24 h后消失。這說明了miRNA-208在作為IHD早期診斷標(biāo)志物時較常規(guī)生物標(biāo)志物具有峰值時間更早的優(yōu)勢。因此，miRNA-208可作為一種新的IHD早期診斷生物學(xué)指標(biāo)。D'Alessandra等〔17〕發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者外周血中的miRNA-1的上調(diào)與cTnⅠ水平相關(guān)，且具有相同的峰值時間。Cheng等〔18〕在大鼠心肌梗死模型及臨床心肌梗死患者的研究中獲得相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miRNA-1在心肌梗死后迅速表達，并在梗死后6 h達到高峰，3 d后降至基線水平。以上研究均提示miRNA-1亦可能作為IHD新的生化標(biāo)記物。此外，Adachi等〔19〕對急性冠脈綜合征病人進行研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-499僅在急性心肌梗死后明顯升高且對心肌有高度的特異性。這意味著miRNA-499可預(yù)期同cTnⅠ、CK-MB一樣能對IHD做出早期診斷。

2.2miRNA作為IHD預(yù)后生物標(biāo)志物 近期研究開展了對IHD患者治療前后外周血miRNA 動態(tài)變化的相關(guān)研究，以便探討miRNA 在疾病預(yù)后評估中的意義。IHD患者進行運動康復(fù)治療后，Taurino 等〔20〕發(fā)現(xiàn)血中miRNA-92a與miRNA-92b 濃度增高，這一發(fā)現(xiàn)可能為IHD康復(fù)治療提供新的判定標(biāo)準(zhǔn)。與此同時，miRNA與心力衰竭之間關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)〔21〕，當(dāng)心力衰竭患者治療好轉(zhuǎn)后，患者外周血中表達上調(diào)的多個不同的miRNA恢復(fù)或接近正常水平。這些研究表明miRNA 在疾病預(yù)后評估中也有著重要的意義。

綜上，目前，miRNA作為IHD生物標(biāo)志物仍處于發(fā)展初期，利用miRNA 作為生物標(biāo)志物檢測仍然存在許多問題，如費用較高、可重復(fù)性較低等。關(guān)于miRNA 在IHD的發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制的研究有待進一步深入。同時，作為生物標(biāo)志物miRNA早期診斷和評價預(yù)后的作用是否更優(yōu)于現(xiàn)有的生物標(biāo)志物如cTn等，還有待進一步研究。

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