盧新衛(wèi) 冷吉燕 杜 健 李修英

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)已成為嚴(yán)重危害人類健康和生命的心血管疾病之一。近年來普遍認(rèn)為各種主要危險(xiǎn)因素終將造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，而粥樣硬化斑塊的形成是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷作出反應(yīng)〔1〕。ROS能誘導(dǎo)各種類型的細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡，主要包括NO、O2-、H2O2、過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)。在血管壁，ROS由AS斑塊處巨噬細(xì)胞形成，在單核細(xì)胞、白細(xì)胞黏附后作用于內(nèi)皮細(xì)胞，參與AS的發(fā)生與發(fā)展。因此，減少ROS的分泌、抑制內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，可能是預(yù)防AS發(fā)生和發(fā)展的重要靶點(diǎn)。研究表明〔2〕，黃酮類植物化合物大多具有明顯的抗氧化生物活性，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞主要通過以下機(jī)制：抗氧化和清除自由基，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)血管緊張度，抑制炎癥反應(yīng)等。藍(lán)莓果實(shí)富含花青素和花色苷，從其果實(shí)中提取的藍(lán)莓花色苷同屬于黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)探討藍(lán)莓花色苷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與主要試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室)、藍(lán)莓花色苷(本課題組先期提取，并已經(jīng)鑒定)、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Hyclone公司)、AngⅡ(美國(guó)Sigma公司)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó) Sigma 公司)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國(guó) Sigma 公司)、鹽酸鹽緩沖液(PBS)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)器材 低溫高速離心機(jī)(美國(guó) Thermo公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)、CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)、細(xì)胞培養(yǎng)板96孔板(美國(guó) Corning 公司)、ROS試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2方法

1.2.1HUVEC的培養(yǎng)、傳代與鑒定 從液氮罐中取出裝有HUVEC的凍存管，放入37℃水浴箱中不斷搖晃，1 min內(nèi)迅速解凍細(xì)胞懸液，隨即于超凈臺(tái)內(nèi)移入無菌離心管，加入2 ml DMEM高糖培養(yǎng)液，吹打均勻后，1 000～1 200 r/min離心3～5 min，棄上清后，再加入DMEM高糖培養(yǎng)液2 ml，吹打成細(xì)胞懸液，種入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液的25 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃含5%CO2孵箱中培養(yǎng)，次日可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，換液。3～5 d長(zhǎng)滿瓶底90%，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，傳代后隔天換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。用Ⅷ因子相關(guān)抗原(SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色法)檢測(cè)陽(yáng)性鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及預(yù)處理 培養(yǎng)瓶中HUVEC生長(zhǎng)至60%左右融合，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，細(xì)胞分組處理：(1)空白對(duì)照組(Control)：HUVEC用含10%FBS+DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)AngⅡ誘導(dǎo)組(AngⅡ)：HUVEC分別用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L AngⅡ+10% FBS+DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。(3)藍(lán)莓花色苷組(BBA)：HUVEC分別用80、40、20、10、5、2.5 μg/ml藍(lán)莓花色苷+10%FBS+ DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。(4)AngⅡ+藍(lán)莓花色苷干預(yù)組(AngⅡ+BBA)：HUVEC在含有20 μg/ml藍(lán)莓花色苷的培養(yǎng)液中孵育2 h后，再加入10-6mol/L AngⅡ，共同孵育24 h。上述各組細(xì)胞均置于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3MTT法檢測(cè)HUVEC活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC一瓶，超凈臺(tái)內(nèi)用PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化獲得細(xì)胞后計(jì)數(shù)，設(shè)定每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液；無菌條件下將細(xì)胞懸液按200 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液；根據(jù)上述不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組加藥，設(shè)不加細(xì)胞不加藥組為調(diào)零孔；培養(yǎng)一定時(shí)間后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h后，可見有紫藍(lán)色的甲臜結(jié)晶形成，小心吸取孔內(nèi)上清液，棄去后每孔加入150 μl DMSO溶液，搖床上充分振蕩10 min，溶解結(jié)晶；選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光值(OD)值，并記錄結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4ROS的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后以7×104/ml細(xì)胞懸液接種于96孔板中，次日給藥，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。給藥24 h后，吸取各孔內(nèi)上清液并棄去，用PBS洗2遍后，每孔中加入100 μl PBS，按照-80℃ 5 min，室溫下融化，反復(fù)凍融3次，收集50 μl上清液備用。按照ROS測(cè)定試劑盒說明書嚴(yán)格操作，測(cè)定胞內(nèi)ROS水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1AngⅡ?qū)UVEC增殖活性的影響 給藥24 h后各濃度AngⅡ?qū)UVEC的增殖都有抑制作用，有一定的濃度依賴性，濃度≥10-6mol/L時(shí)對(duì)HUVEC的增殖抑制作用更加顯著。與空白對(duì)照組比較，AngⅡ濃度為10-6mol/L時(shí)細(xì)胞增殖被抑制了27%(P<0.01)；給藥48 h后，AngⅡ誘導(dǎo)組各濃度對(duì)HUVEC的增殖都有抑制作用，有明顯的劑量依賴，與空白對(duì)照組比較，AngⅡ濃度為10-6mol/L時(shí)細(xì)胞的增殖被抑制了32%(P<0.01)。選取10-6mol/L作為AngⅡ最適實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2藍(lán)莓花色苷對(duì)HUVEC增殖活性的影響 給藥24 h后，低濃度藍(lán)莓花色苷可輕度增加 HUVEC的活性；呈濃度依賴性，當(dāng)濃度≥40 μg/ml時(shí)出現(xiàn)抑制作用，也有一定的濃度依賴性；與空白對(duì)照組比較，最高濃度使細(xì)胞增殖抑制了11%(P<0.01)；給藥48 h后，藍(lán)莓花色苷濃度≥40 μg/ml時(shí)對(duì)HUVEC的增殖亦有抑制作用，與空白對(duì)照組比較，最高濃度時(shí)細(xì)胞的增殖被抑制了16%(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)選取20 μg/ml作為藍(lán)莓花色苷的最適實(shí)驗(yàn)濃度。

2.3藍(lán)莓花色苷對(duì)HUVEC內(nèi)ROS的影響 藍(lán)莓花色苷干預(yù)組HUVEC胞內(nèi)ROS的水平下降，抑制了胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

3 討 論

內(nèi)皮細(xì)胞位于血管壁的最內(nèi)層，不僅是血管的保護(hù)屏障，更是人體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，其合成與釋放的舒血管活性物質(zhì)與縮血管活性物質(zhì)對(duì)維持正常的血管功能尤其是血管舒縮狀態(tài)至關(guān)重要。內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌ROS、NO、PGI2以及ET、AngⅡ等血管活性肽調(diào)節(jié)血管張力〔3〕。內(nèi)皮依賴性收縮和舒張因子的失衡可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷和障礙，多種疾病如高血壓病、糖尿病、代謝綜合征、腫瘤以及炎癥等與內(nèi)皮功能障礙具有密切關(guān)系〔4〕。縮血管因子AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的重要組成部分，AngⅡ通過血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)誘導(dǎo)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)的表達(dá)，而LOX-1的激活能上調(diào)AT1R的表達(dá)，ACEI則能抑制NADPH氧化酶的活化，減少ROS的生成〔5，6〕。研究表明，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的LOX-1表達(dá)與ROS-NF-κB信號(hào)途徑激活存在正反饋效應(yīng)〔7〕。

藍(lán)莓花色苷是從藍(lán)莓果實(shí)中提取的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、清除自由基〔8〕，降低血脂等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用〔9，10〕。隨著細(xì)胞培養(yǎng)和免疫組化技術(shù)的發(fā)展，黃酮類植物化合物在多種代謝性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等的作用機(jī)制研究也將越來越深入。

4 參考文獻(xiàn)

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